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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.53 no.1 Belo Horizonte Feb. 2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352001000100012 

Efeito de sistema de cultivo, célula somática e soro em co-cultura sobre o desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro

(Effects of culture system, somatic cells and serum in co-culture on the development of in vitro fertilized bovine embryos)

 

L.S.A. Camargo1, W.F. 1, A.M. Ferreira1, J.H.M. Viana2

1Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite – Embrapa
Rua Eugênio do Nascimento, 610 - Bairro Dom Bosco
36038-330 - Juiz de Fora, MG
2Doutorando - Escola de Veterinária da UFMG

 

Recebido para publicação, após modificações, em 17 de outubro de 2000
E-mail: camargo@cnpgl.embrapa.br

 

 

RESUMO

O objetivo deste experimento foi o de avaliar o efeito de sistemas de cultivo e de diferentes células somáticas e soro bovino na co-cultura sobre a produção de embriões bovinos fecundados in vitro. No experimento um avaliou-se o efeito do sistema de co-cultura com células da tuba uterina e do sistema "definido". No experimento dois utilizaram-se células da granulosa ou da tuba uterina para a co-cultura em meio CR1aa (Charles Rosenkrans). No experimento três utilizou-se soro de vaca em cio (SVC) ou soro fetal bovino (SFB), ambos em co-cultura com células da granulosa em CR1aa. Os ovócitos utilizados foram obtidos de ovários colhidos em matadouro e maturados in vitro em meio 199 com soro de vaca em cio e FSH por 24h. Após a maturação, os ovócitos foram fecundados in vitro por 22h e posteriormente divididos aleatoriamente nos tratamentos. Avaliaram-se a taxa de clivagem no dia três do cultivo, a produção de blastocistos nos dias sete e oito, e de blastocistos eclodidos nos dias nove e dez. Não houve diferença entre os sistemas em co-cultura e "definido" quanto à taxa de clivagem (80,7% e 75,4%) e de produção de blastocisto (19,4% e 17,7%). Entretanto, a taxa de blastocistos eclodidos foi superior para o sistema em co-cultura (37,5%) quando comparado com o sistema "definido" (8,7%). O cultivo embrionário em células da tuba uterina ou da granulosa resultaram em taxas de clivagem, produção de blastocisto e blastocistos eclodidos semelhantes entre si (65,5% e 66,7% de clivagem, 11,6% e 13,7% de blastocistos e 23,1% e 50,0% de blastocistos eclodidos; P>0,05), bem como o cultivo com SFB ou SVC (63,9% e 70,2% de clivagem, 14,3% e 8,7% de blastocisto e 41,2% e 33,3% de blastocistos eclodidos; P>0,05). Conclui-se que o sistema de cultivo "definido" pode ser utilizado para estudos com cultivo de embriões in vitro, no entanto, os resultados quanto à taxa de eclosão ainda são inferiores ao sistema em co-cultura. As células da granulosa e da tuba uterina possuem efeito semelhante sobre o desenvolvimento embrionário, assim como o soro de vaca em cio e o soro fetal bovino, quando em co-cultura.

Palavras-chaves: Bovino, soro fetal, soro de vaca em cio, célula somática, cultivo de embrião in vitro

 

ABSTRACT

The aims of this study were to evaluate the effects of culture system and different somatic cells and bovine serum in co-culture on in vitro production of bovine embryos. On the first experiment oviduct epithelial cells for co-culture system in CR1aa (Charles Rosenkrans) medium for "defined" system were studied. On the second experiment granulosa or oviduct epithelial cells, both in CR1aa medium were used. On the third experiment estrous cow serum (ECS) or fetal calf serum (FCS), both in granulosa cells co-culture in CR1aa medium was used. Bovine cumulus-oocytes complexes, obtained from ovaries collected at slaughterhouse, were matured in vitro in medium 199 added with ECS and FSH for 24h. Right after, the oocytes were fertilized in vitro for 22h and randomly divided in the treatments of the experiments. The cleavage rate was evaluated on day three, the blastocyst production on seventh and eighth days and the hatched blastocysts on ninth and tenth days. No differences were obtained (P>0.05) between co-culture and "defined" systems on the cleavage rate (80.7% and 75.4%) and on the blastocysts production (19.4% and 17.7%). However, the hatched blastocyst rate was higher (P<0.05) in the co-culture than in the "defined" system (37.5 and 8,7%, respectively). Similar results of embryo co-culture in oviduct epithelial and granulosa cell cultures were obtained regarding to similar cleavages, blastocyst and hatched blastocyst rates (65.5% and 66.7% of cleavage, 11.6% and 13.7% of blastocyst and 23.1% and 50.0% of hatched blastocyst; P>0.05), as well as with FCS and ECS (63.9% and 70.2% of cleavage, 14.3% and 8.7% of blastocyst and 41.2% and 33.3% of hatched blastocyst; P>0,05). The results show that the "defined" system can be used for in vitro embryo culture studies. Nevertheless, the hatched blastocyst rate was higher in co-culture system. Granulosa and oviduct epithelial cells had similar effects on the in vitro embryonic development. Similar results were also obtained using estrous cow serum and fetal calf serum, when in granulosa cells co-culture.

Keywords: Cattle, fetal calf serum, estrous cow serum, somatic cell, in vitro embryo culture.

 

 

INTRODUÇÃO

Entre os sistemas de cultivo in vitro de embriões bovinos, o mais utilizado tem sido o da co-cultura de células somáticas, principalmente com células da tuba uterina ou da granulosa (Marquant-Le Guienne & Humblot, 1998), adicionado de soro fetal bovino ou de soro de vaca em cio (Costa, 1994; Galli & Lazzari, 1996). Presume-se que a co-cultura favoreça o desenvolvimento dos zigotos recém-fecundados até o estádio de blastocisto, para que ultrapasse o estádio de 8 a 16 células, o qual é caracterizado por um bloqueio do desenvolvimento embrionário in vitro (Minami, 1996). A hipótese baseia-se na possibilidade das células utilizadas na co-cultura removerem as substâncias embriotóxicas do meio de cultivo e/ou secretarem fatores embriotróficos que estimulem o desenvolvimento embrionário (Thibodeaux & Godke, 1992). O soro também pode fornecer fatores benéficos ao meio de cultivo do embrião, como os de crescimento (Bavister, 1995). Tem-se utilizado soro de vaca em cio e células da granulosa durante a maturação in vitro do ovócito (Fukui & Ono, 1989). No entanto, para o cultivo do embrião fecundado in vitro tem-se utilizado com mais freqüência o soro fetal bovino e a co-cultura com células da tuba uterina (Konishi & Aoyagi, 1994; Feng et al., 1994), embora outros autores tenham trabalhado com células da granulosa e soro de vaca em cio (Shamsuddin et al., 1994; O’Doherty et al. 1997). Ainda não está claro se há diferença entre esses tipos de células ou soro quando do cultivo em co-cultura sobre o desenvolvimento embrionário em bovinos. Nesse sistema de cultivo, tem-se utilizado o TCM (Tissue Culture Medium) 199 ou CR1aa (Rosenkranks & First, 1994) como meio de cultivo das células (Konishi & Aoyagi, 1994; Galli & Lazzari, 1996).

Outro sistema de cultivo é o denominado "definido" (Marquant-Le Guienne & Humblot, 1998), no qual não se utiliza a co-cultura e visa principalmente controlar melhor as condições de cultivo para o estudo da embriogênese. Os resultados quanto à produção e qualidade do embrião têm sido controversos quando aquele sistema é comparado com o sistema de co-cultura adicionado de soro (Shamsuddin et al., 1994; Donnay et al., 1997).

O objetivo deste trabalho foi o de comparar o sistema de cultivo em co-cultura com o sistema "definido", e verificar o efeito do tipo de célula somática e do tipo de soro, ambos em sistema de co-cultura, sobre o desenvolvimento embrionário de zigotos bovinos fecundados in vitro.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados ovócitos aspirados de ovários de fêmeas bovinas mestiças, coletados em matadouro. Os ovários foram transportados até o laboratório em frascos com solução fisiológica (0,9% NaCl) contendo antibiótico (0,05 g/litro de sulfato de estreptomicina), à temperatura entre 30 e 35ºC, em um período de até quatro horas após a coleta.

Os folículos com diâmetro superior a 1,5mm foram puncionados e o conteúdo depositado em um cálice cônico contendo meio Talp Hepes, previamente aquecido a 37ºC. Após 10 minutos para decantação, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi lavado com meio Talp Hepes e depositado em uma placa de Petri. Os ovócitos contendo células do "cumulus oophorus" compacto, com no mínimo três camadas e citoplasma homogêneo, foram levados para a maturação in vitro em meio TCM 199 acrescido de 10% de soro de vaca em cio (SVC) e 20 mg/ml de FSH, conforme descrito por Costa (1994), durante 24 horas em estufa incubadora de CO2.

Para a fecundação in vitro utilizou-se sêmen descongelado de touro mestiço (5/8 HZ). Os espermatozóides móveis foram selecionados pelo método de swin up e capacitados durante 15 minutos com 100 mg/ml de heparina, em estufa incubadora a 38,8ºC e 5% de CO2 em ar atmosférico, antes de irem para o meio de fecundação. Após a maturação os ovócitos foram transferidos para o meio de fecundação, acrescido de 1,8 ´ 106 espermatozóides/ml, onde permaneceram por 22h, em estufa incubadora de CO2.

Ao término desse período, os ovócitos foram divididos aleatoriamente entre os tratamentos, de acordo com os experimentos. No experimento 1 avaliaram-se os sistemas de cultivo em co-cultura e o sistema "definido". O sistema de cultivo em co-cultura consistiu de monocamada de células da tuba uterina em meio TCM 199 acrescido de 10% de SVC (tratamento SC; n=124) e o sistema de cultivo "definido" consistiu de meio CR1aa acrescido de 3 g/litro de BSA (tratamento SD; n=130). No experimento 2 avaliou-se o sistema de cultivo em co-cultura com monocamada de células da tuba uterina (tratamento T; n=112) ou com células da granulosa (tratamento G; n=117), ambos em 10% de SVC em meio CR1aa. O experimento 3 avaliou o sistema de co-cultura com células da granulosa com 10% de SVC (tratamento C; n=104) ou de soro fetal bovino (tratamento F; n=119), ambos em meio CR1aa.

Os cultivos foram realizados em gotas de 100ml sob óleo mineral e metade do meio foi trocado a cada 48 horas. A avaliação da clivagem foi feita no terceiro dia pós-fecundação, a taxa de blastocisto no sétimo e oitavo dias e a taxa de blastocisto eclodido no nono e décimo dia. Para obtenção de células da tuba uterina foi utilizado material coletado em matadouro, oriundo de vacas ou novilhas "vazias". O transporte do material foi realizado em solução fisiológica acrescida de 0,05 g/litro de sulfato de estreptomicina em temperatura ambiente. No laboratório a tuba uterina foi lavada em solução fisiológica e feita a extração mecânica das células epiteliais. Após a extração, as células foram lavadas quatro vezes em meio Talp Hepes antes de serem levadas para o meio de cultivo em TCM 199 ou CR1aa.

Para a obtenção das células granulosas utilizaram-se ovários obtidos em matadouro, transportados nas mesmas condições realizadas para obtenção dos ovócitos. No laboratório, o líquido folicular de folículos entre 8 e 12mm de diâmetro foi aspirado e desprezado e o folículo lavado com Talp Hepes por três vezes para a remoção das células da granulosa. Após esse procedimento, o conteúdo obtido foi lavado quatro vezes em Talp Hepes, antes de ir para o cultivo em CR1aa. As células da tuba uterina e da granulosa foram cultivadas durante dois dias em incubadora de CO2, antes de receberem os ovócitos recém-fecundados.

A maturação, a fecundação e o cultivo embrionário in vitro e das células da tuba uterina e granulosa foram realizados em estufa incubadora com 5% de CO2 em ar atmosférico com 95% de umidade e 38,8ºC.

Os experimentos foram conduzidos com quatro repetições para cada tratamento e a análise estatística realizada pelo teste do qui-quadrado (Gomes, 1987)

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No experimento 1 não se observou diferença (P>0,05) na taxa de clivagem e na produção de blastocisto entre o sistema de co-cultura com células da tuba uterina e o sistema "definido" em meio CR1aa (Tab. 1). Isso mostra que o sistema de cultivo "definido" apresenta uma capacidade de desenvolvimento embrionário até estádio de blastocisto semelhante ao sistema de co-cultura. Esse resultado confirma o de outros trabalhos que demonstraram não ser necessária a co-cultura com células somáticas para que o zigoto ultrapassasse o estádio de 8-16 células (Kim et al., 1993; Pinyopummintr & Bavister, 1994), em que normalmente ocorre um bloqueio do desenvolvimento embrionário (Minami, 1996). Quando utilizaram CR1aa em sistema de cultivo "definido", Rosenkranks & First (1994) encontraram taxas de produção de blastocisto entre 21 e 28%, enquanto Salamone et al. (1995) observaram que a adição de soro fetal bovino produziu taxas embrionárias semelhantes ao sistema de co-cultura com células do "cumulus" em TCM 199 (18,9 e 29,4%, respectivamente).

 

 

Entretanto, a taxa de eclosão de blastocistos foi maior (P<0,05) para o sistema de co-cultura, quando comparado com o sistema "definido" (Tab. 1). Segundo Rehman et al. (1994), a eficiência de um sistema de cultivo in vitro pode ser expressa não só pela percentagem de zigotos que se desenvolvem a blastocisto, mas também pela percentagem de blastocistos que eclodem. Embora a taxa de eclosão de blastocistos não constitua uma avaliação definitiva, ela tem sido utilizada para o desenvolvimento embrionário in vitro (Bavister, 1995).

Embriões menos competentes possuem desenvolvimento embrionário mais lento durante o cultivo, resultando em blastocistos de menor qualidade (Bavister, 1995), provavelmente com menor número de células. Tem-se também observado em seres humanos que embriões cultivados in vitro apresentam dificuldade de eclodir (Dokras et al., 1991). A menor taxa de eclosão de blastocistos observada no sistema "definido" pode ser reflexo da menor competência desses embriões nesse estádio, aumentando seu grau de dificuldade em eclodir.

Segundo Bavister (1995), diferenças de resultados observadas entre laboratórios podem ser devido à qualidade da água utilizada para o meio de cultivo, assim como outros aspectos que provocam a baixa qualidade de um sistema "definido". Para esse mesmo autor, quando as condições de qualidade do cultivo são baixas, há tendência do sistema de co-cultura ser melhor do que o "definido", pelo fato de as células somáticas serem menos sensíveis a alterações de qualidade, as quais poderiam diminuir, em parte, os efeitos maléficos de alguma alteração durante o cultivo embrionário.

Como o efeito do sistema de co-cultura sobre o embrião fecundado in vitro pode ser proveniente da célula ou do soro utilizado durante o cultivo (Konishi & Aoyagi, 1994; Bavister, 1995), no experimento 2 procurou-se verificar se haveria diferenças quanto ao tipo de células utilizadas na co-cultura com soro de vaca em cio, e no experimento 3 procurou-se avaliar possíveis diferenças entre soro fetal bovino e soro de vaca em cio, quando em co-cultura com células da granulosa. Em ambos os experimentos não foi observada diferença (P>0,05) quanto à produção de blastocisto e eclosão entre os tipos de células ou de soros utilizados (Tab. 2). Tanto as células da granulosa, ou células da tuba uterina, como o soro da vaca em cio, ou soro fetal bovino em co-cultura, promoveram resultados semelhantes quanto ao desenvolvimento embrionário. Segundo Feng et al. (1994), embora ambos os tipos de células possam secretar fatores embriotróficos, é possível que produzam fatores benéficos diferentes ou quantidades diferentes de um mesmo fator. Os autores observaram que a co-cultura em células da tuba uterina foi mais eficiente do que em células da granulosa. Entretanto, outros resultados indicam que sistemas de co-cultura em células da granulosa produzem efeitos parecidos com outros tipos de co-cultura, com a vantagem dessas células poderem ser obtidas juntamente com a aspiração do folículo (Thibodeaux & Goke, 1992).

 

 

Tem-se observado que a utilização de soro de vaca em cio aumenta a blastulação de embriões bovinos (Shamsuddin et al., 1994). Da mesma forma, o soro fetal bovino aumenta a taxa de produção de blastocistos e o número de células, o que pode ser atribuído a algum componente sérico de alta massa molecular (Van Langendonckt et al., 1997). De acordo com resultados aqui obtidos, os efeitos produzidos entre os tipos de células ou entre os tipos de soro estudados são parecidos, demonstrando que o efeito positivo de um sistema de cultivo em co-cultura, quando comparado com o sistema "definido", pode ser conseguido de maneira semelhante por esses tipos de células somáticas e soros.

Diversos fatores que parecem estar envolvidos no desenvolvimento embrionário e na eclosão de blastocistos, tais como vitaminas, aminoácidos e fatores do crescimento (Kane & Bavister, 1988; Bavister, 1995; Gardner, 1998), podem ser produzidos pelas células utilizadas na co-cultura ou estar presentes no soro utilizado nesse sistema de cultivo. A eclosão in vitro de blastocistos envolve uma seqüência de eventos que leva à lise da zona pelúcida. Em hamster, vitaminas como o inositol e colina parecem estar envolvidas na eclosão in vitro de blastocistos (Kane & Bavister, 1988). Vários aminoácidos estimulam a formação do blastocisto e aumentam a taxa de eclosão em blastocistos de camundongos (Lane & Gardner, 1997) e estão presentes nas secreções tubáricas de ovelhas (Moses et al., 1997). Fatores de crescimento como LIF (fator inibitório da leucemia) melhoram o desenvolvimento do blastocisto à eclosão (Lavramos et al., 1995). Segundo Kane et al. (1997), o principal efeito do LIF está na preparação do útero para a implantação, mas pode haver algum efeito direto sobre o blastocisto. O EGF (fator de crescimento epidérmico) estimula a produção e eclosão in vitro de blastocistos bovinos e pode ser encontrado no soro fetal bovino (Keefer et al., 1994). Outros fatores de crescimento encontrados nas secreções das células da tuba uterina estimulam a proliferação celular, como TGF a e IGF 1 (Ghosh & Sengupta, 1998).

Segundo Bavister (1995), o soro possui fatores benéficos para o desenvolvimento embrionário, como aminoácidos, vitaminas e fatores de crescimento. O soro tem um efeito bifásico no desenvolvimento embrionário, melhorando o desenvolvimento a partir do estádio de mórula, estimulando a eclosão de embriões bovinos (Pinyopummintr & Bavister, 1994) e ovinos (Thompson et al., 1992).

O efeito das células e do soro na co-cultura, através de seus componentes e metabolismo, pode não ser visualizado quando se avalia a taxa de produção de blastocistos, mas pode aumentar a viabilidade dos embriões durante o cultivo in vitro, aumentando as possibilidades de um blastocisto eclodir, quando comparado com um sistema de cultivo "definido".

Portanto, apesar da taxa de produção de blastocistos não ser diferente entre os sistemas de cultivo testados, a taxa de eclosão para o sistema de cultivo "definido" foi inferior (P<0,05). Isso sugere a existência de algum efeito do sistema de co-cultura sobre os blastocistos, propiciando um ambiente mais adequado para a eclosão. Esse efeito parece ser independente do tipo de célula ou soro utilizado nesse sistema de cultivo, pois tanto a utilização de células da granulosa ou da tuba uterina quando em cultivo com soro de vaca em cio, quanto a utilização do soro de vaca em cio ou soro fetal bovino quando em co-cultura com células da granulosa apresentaram resultados semelhantes.

 

CONCLUSÕES

A utilização de sistemas de cultivo em co-cultura ou "definido" proporcionam taxa de clivagem e de produção de blastocistos semelhantes, enquanto a taxa de eclosão dos blastocistos é maior para o sistema de co-cultura. Isto sugere que fatores presentes no sistema de co-cultura podem ser necessários para a eclosão de blastocistos. Esses fatores podem ser produzidos tanto pelas células da granulosa ou da tuba uterina como podem estar presentes no soro fetal bovino ou de vaca em cio.

 

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