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Arquivos do Instituto Biológico

versão impressa ISSN 0020-3653versão On-line ISSN 1808-1657

Arq. Inst. Biol. vol.83  São Paulo  2016  Epub 21-Nov-2016

https://doi.org/10.1590/1808-1657000972014 

SCIENTIFIC ARTICLE

Relação entre níveis de fumonisina B1 e ácido fólico em farinha de milho e a concentração de ácido fólico no soro humano

Relationship between fumonisin B1 and folic acid levels in foods and the folic acid concentration in human serum

Keliani Bordin1 

Matheus Tres1 

Pollyana Cristina Maggio de Castro Souto1 

Mayra Carraro Di Gregorio1 

Carlos Humberto Corassin1 

Carlos Augusto Fernandes de Oliveira1  * 

1Departamento de Engenharia de Alimentos; Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos; Universidade de São Paulo (USP) - Pirassununga (SP), Brasil.


RESUMO:

Neste trabalho foram determinados os níveis de ácido fólico e de fumonisina B1 (FB1) em farinha de milho consumida por 24 voluntários residentes em um campus universitário no estado de São Paulo, bem como sua relação com as concentrações de ácido fólico sérico nos indivíduos. As análises de ácido fólico e de FB1 em farinha de milho foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), enquanto a determinação de ácido fólico sérico foi feita por kit de imunoensaio. Detectou-se a FB1 em 100% das amostras de farinha de milho, em níveis que variaram de 142 a 3.037 µg kg-1 (média: 738 ± 591 µg kg-1). As concentrações de ácido fólico nas amostras de farinha de milho ficaram entre < 0,3 µg kg-1 (limite de quantificação) e 1.705 µg kg-1, com média de 713 ± 435 µg kg-1, o que representa 47% do limite mínimo exigido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para farinhas de milho comercialmente disponíveis. Nas amostras de soro humano, os níveis de ácido fólico variaram de 6,7 a 24,0 ng mL-1 (média: 13,4 ± 5,4 ng mL-1). Não houve correlação (p < 0,05) entre os níveis de ácido fólico no soro dos indivíduos e as concentrações de FB1 ou ácido fólico nas amostras de farinha de milho. Outros estudos são necessários para estimar a ingestão total de FB1 por meio da dieta para averiguar os efeitos das fumonisinas sobre a absorção de ácido fólico nos indivíduos avaliados.

PALAVRAS-CHAVE: fumonisina B1; ácido fólico; soro; análise

ABSTRACT:

In the present study, folic acid and fumonisin B1 (FB1) levels were determined in corn flour consumed by 24 volunteers, residents in a university campus in São Paulo State, as well as its relationship with folic acid in serum of individuals. Analyses of folic acid and FB1 in corn flour were performed by high-performance liquid chromatography (HPLC), while the determination of folic acid in serum was accomplished using an immunoassay kit. FB1 was detected in 100% of corn samples, at levels ranging from 142 to 3,037 µg kg-1 (which means: 738 ± 591 µg kg-1). The concentrations of folic acid in corn flour samples ranged from < 0.3 µg kg-1 (limit of quantification) to 1,705 µg kg-1, with a mean of 713 ± 435 µg kg-1, which represents 47% of the minimum required by National Agency of Health Surveillance (ANVISA) for corn flour commercially available. The levels of folic acid in human serum samples ranged from 6.7 to 24.0 ng mL-1 (meaning: 13.4 ± 5.4 ng mL-1). No correlations were observed (p < 0.05) between the folic acid levels in serum of individuals and the concentrations of FB1 or folic acid in corn flour samples. Further studies are needed to estimate the total intake of FB1 in the diet to assess the effects fumonisins on the absorption of folic acid in the individuals evaluated.

KEYWORDS: fumonisin B1; folic acid; serum analysis

INTRODUÇÃO

As fumonisinas são metabólitos secundários tóxicos produzidos por fungos do gênero Fusarium , sobretudo Fusarium verticillioides, encontrado frequentemente em milho e derivados (Who, 2002). Até o presente, foram identificados 28 compostos análogos designados por fumonisinas, sendo a fumonisina B1 (FB1) o composto com maior poder toxigênico e com mais frequência achado em alimentos, constituindo cerca de 70% da contaminação natural por fumonisinas (Domijan, 2012). Os efeitos da exposição às fumonisinas em seres humanos por meio da dieta ainda permanecem incertos (Voss et al., 2014), no entanto, a ingestão de FB1 em alimentos vem sendo relacionada com a incidência de câncer esofágico em algumas regiões da China (Chu; Li, 1994), África (Rheeder et al., 1992), Irã (Alizadeh et al., 2012), norte da Argentina (Solfrizzo et al., 2004) e Brasil (Westhuizen et al., 2003). A FB1 foi classificada pela International Agency for Research on Cancer (IARC) como pertencente ao grupo 2B, ou seja, possível carcinógeno em humanos (Iarc, 2002).

A ingestão de FB1 também foi ligada à ocorrência de defeitos no tubo neural (DTN) em mulheres residentes na fronteira do Texas, Estados Unidos, com o México. Nessa região, a incidência de DTN dobrou no mesmo período em que houve um surto epizoótico associado à contaminação de milho por fumonisinas (Missmer et al., 2006). Incidências relativamente elevadas de DTN também foram observadas em regiões da África do Sul (35-61/10 mil habitantes), norte da China (57-73/10 mil habitantes) e Guatemala (até 106/10 mil habitantes), onde a população possui elevada exposição à toxina, pela utilização do milho como base alimentar (Marasas et al., 2004).

O desenvolvimento de DTN possui origem multifatorial, e a suplementação com ácido fólico tem indicado redução na ocorrência dessa enfermidade, podendo auxiliar na proteção e no desenvolvimento do feto (Waes et al., 2009). Estudos anteriores realizados com animais demonstraram que o ácido fólico (in vivo ) e o ácido folínico (in vivo e in vitro ) podem diminuir a incidência de exencefalia em embriões tratados com FB1 (Sadler et al., 2002). Em estudo feito em São Paulo, Fujimori et al. (2013) descreveram a redução de DTN após a fortificação obrigatória de farinhas de milho e trigo. A FB1 causa interrupção no metabolismo de esfingolipídios, o que interfere na absorção celular de diversos nutrientes, principalmente de folatos (Stevens; Tang, 1997). Essa deficiência intracelular da vitamina, ocasionada pela depleção de esfingolipídeos induzida pela FB1, tem sido considerada como um possível mecanismo para a indução de DTN pelas fumonisinas (Marasas et al., 2004).

No Brasil, a contaminação de alimentos por fumonisinas tem sido tratada por diversos autores, de maneira especial no milho e derivados (Bittencourt et al., 2005; Moreno et al., 2009; Bordin et al., 2014), contudo não há estudos que avaliem os níveis de FB1 e ácido fólico na dieta, ou a associação entre essas variáveis e as concentrações séricas de ácido fólico.

No presente artigo foram investigados os níveis de FB1 e ácido fólico em farinha de milho disponível nas residências de voluntários e sua relação com a concentração de ácido fólico no soro dos indivíduos.

MATERIAL E MÉTODOS

Seleção de voluntários e coleta das amostras

Foram selecionados 24 voluntários com idades entre 10 e 60 anos entre funcionários residentes em um campus universitário no estado de São Paulo, no mês de junho de 2011. Adotou-se, como critério para inclusão no estudo, histórico clínico de cada voluntário demonstrando ausência de doenças crônicas nos dois anos anteriores à investigação, de acordo com os registros da Unidade Básica de Saúde (UBAS) do campus . A inclusão de cada indivíduo no estudo foi realizada por manifestação voluntária de concordância, sendo ela registrada por meio de termo de consentimento livre e esclarecido e assinada individualmente pelos voluntários. O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP, processo do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto nº 7.962/2010).

No dia anterior às coletas de sangue, entregaram-se às residências dos participantes um frasco graduado para registro da quantidade de amostra de farinha de milho coletada (mínimo de 150 g) e sacos herméticos previamente identificados para acomodar as amostras. Os voluntários foram instruídos a coletar os alimentos na forma como se encontravam na residência (dispostos nas embalagens originais, previamente abertas ou fechadas, porém em conformidade com a data de validade do produto) e a levá-las no momento das coletas de sangue à UBAS. Após a coleta, as amostras de farinha de milho foram armazenadas a -20ºC até o momento das análises.

Os procedimentos para coleta e tratamento inicial das amostras de sangue aconteceram segundo as recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso. Após a coagulação, os frascos contendo as amostras de soro foram devidamente identificados e armazenados a -80ºC, para posterior realização das análises.

Determinação de fumonisina B1 em farinha de milho

A extração foi realizada com solução de metanol-água (3:1, v/v) e purificada pelo uso de colunas de troca iônica forte (SAX), segundo Shephard et al. (1990). O eluato foi evaporado a 40ºC, reconstituído em 200 µL de solução acetonitrila-água (50:50, v/v) e derivatizado com solução de ο-ftaldialdeído (OPA) previamente preparada. O extrato final foi filtrado em membrana PTFE 0,45 µm e injetado em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (Shimadzu, Quioto, Japão), equipado com detector de fluorescência (excitação de 360 nm e emissão 440 nm) e coluna C18 com dimensões de 4,6 × 250 mm, 5 µm (Shimadzu, Quioto, Japão).

A fase móvel isocrática foi composta de água-acetonitrila-ácido acético (50:50:1, v/v/v), utilizando-se o fluxo de 1 mL min-1. As curvas de calibração foram obtidas com padrões de FB1 preparados em triplicata nas concentrações 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 µg mL-1, os quais foram derivatizados conforme descrito para as amostras. Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) de FB1 foram determinados considerando-se a relação sinal/ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente. Nessas condições os valores de LD e LQ foram 30 e 100 µg kg-1, nessa ordem.

O método de análise foi avaliado previamente, obtendo-se recuperações médias de 77,6 a 103,6% e coeficientes de variação de 3,0 a 25,2% para amostras fortificadas com FB1 em níveis de 100 a 1.000 µg kg-1 (Bordin et al., 2014).

Determinação de ácido fólico em farinha de milho

A extração e quantificação de ácido fólico nas amostras de farinha de milho foram realizadas segundo o método descrito por Heudi et al. (2005). Extraíram-se as amostras com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2M em banho de ultrassom por 10 minutos. Uma alíquota da solução foi removida e filtrada em PTFE 0,45 µm, sendo 20 µL injetados em sistema CLAE (Shimadzu, Quioto, Japão) equipado com detector de luz ultravioleta/visível e ajustado em comprimento de onda de 270 nm. A quantificação aconteceu por coluna de fase reversa C18 250 × 4,6 mm, 5 µm. A fase móvel foi composta de água-acetonitrila-ácido fosfórico (90:10:1, v/v/v). O limite de quantificação obtido foi de 0,3 µg kg-1, e a faixa linear do método, determinada desse nível até 3,4 µg kg-1.

Determinação de ácido fólico em soro

A determinação de ácido fólico (na forma de folatos) nas amostras de sangue foi realizada no laboratório de análises clínicas Centrolab (Leme, São Paulo, Brasil), utilizando-se estritamente os procedimentos do kit de imunoensaio ADVIA Centaur Folate, por método de quimioluminescência (Siemens, Washington DC, Estados Unidos). Nessa análise, o folato presente na amostra competiu com o folato marcado com éster de acridina (provido com o kit ) por uma quantidade limitada da proteína de ligação ao folato marcado com biotina. Na determinação, a amostra foi previamente tratada para liberar o folato das proteínas de ligação endógena na amostra. Quatro amostras de soro foram avaliadas em cinco diferentes dias nos níveis de 3,85, 12,00, 22,67 e 33,86 nmol mL-1, obtendo coeficiente de variação de 10,00, 7,61, 8,50 e 8,93%, respectivamente, entre as repetições feitas. A faixa de trabalho do kit estabelecido pelo fabricante é de 0,35 a 24,0 ng mL-1 (0,79-54,36 nmol mL-1).

Os resultados das análises de FB1 e ácido fólico nas amostras de farinha de milho e soro foram utilizados para determinar o coeficiente de correlação de Pearson (r), e a significância foi testada ao nível de probabilidade de 0,05 (Berquó et al., 1981).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 1 apresenta as concentrações de FB1 e ácido fólico nas amostras de farinha de milho, bem como de ácido fólico no soro dos voluntários. A FB1 foi detectada em 100% das amostras analisadas, em níveis que variaram de 142 a 3.037 µg kg-1 (média: 738 ± 591 µg kg-1), no entanto uma amostra (4,2%) apresentou concentração acima do limite de tolerância estabelecido pela legislação brasileira (2.500 µg kg-1) (Brasil, 2011).

Tabela 1: Concentrações de fumonisina B1 (FB1) e de ácido fólico em farinha de milho disponível nas residências dos voluntários e de ácido fólico no soro dos indivíduos. 

LQ: limite de quantificação do método (0,3 µg kg-1); DP: desvio padrão.

Esses valores são similares aos encontrados em estudo anterior, cujo percentual de amostras positivas para FB1 em amostras de farinha de milho coletadas na região de Pirassununga (SP) foi de 78%, em concentração média de 476 µg kg-1 (Bordin et al., 2014). A incidência de FB1 obtida no presente trabalho foi também semelhante à observada por Bittencourt et al. (2005) em amostras de fubá e farinha de milho comercializadas no município de São Paulo, embora os níveis tenham sido maiores (470 a 15.300 µg kg-1). Contudo alguns fatores dificultam a comparação dos dados obtidos em alimentos disponíveis nas residências, como na presente investigação, com levantamentos nos quais foram analisadas amostras disponíveis no comércio varejista, tais como a coleta de farinhas de embalagens previamente abertas em tempos variados e diferentes condições de armazenagem nas residências.

As concentrações de ácido fólico nas amostras de farinha de milho variaram de < 0,3 (LQ) a 1.705 µg kg-1, com média de 713 ± 435 µg kg-1. Somente uma amostra (4,2%) apresentou nível de ácido fólico acima do valor mínimo estabelecido pela ANVISA para fortificação de farinhas de milho e trigo (1.500 µg kg-1) (Brasil, 2002). Em estudo anterior, Soeiro et al. (2010) encontraram maiores concentrações de ácido fólico em farinha de milho (2.940 a 3.280 µg kg-1) em três diferentes marcas disponíveis no comércio de Campinas (SP). As menores concentrações obtidas no presente trabalho podem ser por conta das perdas de ácido fólico nas farinhas disponíveis nas residências dos voluntários, em condições e tempo de armazenagem distintos, em comparação aos produtos disponíveis no comércio. Esse resultado ressalta a necessidade de tecnologias para prolongar a vida útil do ácido fólico adicionado à farinha de milho e de orientações aos consumidores sobre práticas para a conservação dos produtos após a abertura da embalagem.

Nas amostras de soro humano, os valores alcançados para ácido fólico variaram de 6,7 a 24,0 ng mL-1 (média de 13,4 ± 5,4 ng mL-1), os quais estão coerentes com os dados reportados por Steluti et al. (2011) no Brasil, cuja média foi 9,2 ± 3,4 ng mL-1. Os valores de referência de ácido fólico sérico podem variar amplamente entre as populações e países com diferentes hábitos alimentares, tais como Uganda (5,85 a 10 ng mL-1), Austrália (5,7 a 20,0 ng mL-1), países da União Europeia (3,8 a 16 ng mL-1) e Estados Unidos (8,4 a 35,2 ng mL-1) (Galukande et al., 2011).

No presente estudo, não houve correlação significativa entre os níveis de ácido fólico no soro dos indivíduos e as concentrações de FB1 na farinha de milho (r=-0,22; p=0,28), ou mesmo de ácido fólico nesse alimento (r=0,04; p=0,83). Considerando os níveis baixos de ácido fólico nas amostras de farinha de milho averiguadas, a ausência de correlação entre esses níveis e os de ácido fólico no soro dos indivíduos indica baixa participação do referido alimento para a ingestão global da vitamina e sugere que outras fontes nutricionais de ácido fólico estão presentes na dieta dos voluntários.

Com relação à FB1, mesmo com elevada incidência nas amostras, as concentrações obtidas não foram suficientes para interferir nas concentrações de ácido fólico sérico dos voluntários, no entanto, outros estudos são necessários para estimar a ingestão total de FB1 por intermédio de outros alimentos e seus efeitos sobre a absorção de ácido fólico no grupo populacional avaliado.

CONCLUSÕES

Embora a FB1 tenha sido quantificada em todas as amostras de farinha de milho disponíveis nas residências dos voluntários, os níveis encontrados foram baixos e estavam de acordo com o limite de tolerância adotado no Brasil para essa toxina, com exceção de uma amostra. Inversamente, as concentrações de ácido fólico na farinha de milho estavam abaixo do estabelecido pela legislação brasileira. As concentrações de FB1 ou ácido fólico nas amostras de farinha de milho não apresentaram efeitos sobre os níveis de ácido fólico no soro dos indivíduos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), o suporte financeiro, processo n.º 2010/06291-9.

REFERÊNCIAS

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Recebido: 31 de Outubro de 2014; Aceito: 05 de Outubro de 2016

*Autor correspondente: carlosaf@usp.br

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