Cocultura de embriões Mus musculus com monocamadas de células de linhagens primária e contínua em um sistema sem fluxo externo de CO2

Coculture of Mus musculus embryos with monolayers of primary and continuous lineages in a system without external CO2 flow

COCULTURA DE EMBRIÕES Mus musculus COM MONOCAMADAS DE CÉLULAS DE LINHAGENS PRIMÁRIA E CONTÍNUA EM UM SISTEMA SEM FLUXO EXTERNO DE CO₂

COCULTURE OF Mus musculus EMBRYOS WITH MONOLAYERS OF PRIMARY AND CONTINUOUS LINEAGES IN A SYSTEM WITHOUT EXTERNAL CO₂ FLOW

Marcos Antonio Lemos Oliveira¹ Maria Madalena Pessoa Guerra² Paulo Fernandes de Lima³ Benjamin Gaylord Brackett⁴

RESUMO

A eficiência de três monocamadas celulares (linhagem contínua - células Madin and Darby Bovine Kidney/ MDBK;linhagem primária - células de útero e de oviduto bovino) foi testada para verificar a existência de especificidade celular através do desenvolvimento de embriões, desde o estádio de duas células até o de mórula compacta, em um sistema de cocultura sem fluxo externo de CO₂. Depois da seleçâo, os embriões (n = 343) foram aleatoriamente distribuídos em diferentes tubos de ensaio, os quais foram colocados a 37°C durante 72 horas. Após o período de cocultura, as porcentagens de mórulas compactas obtidas foram de 87,7% em células de oviduto, 86,2% na monocamada de células uterinas e 88,3% na de células MDBK. Não foi observada diferen- ça significativa entre esses valores e, por isso mesmo, conclui-se que a especificidade celular não é importante para o desenvolvimento in vitro de embriões Mus musculus.

Palavras-chave: embrião. Mus musculus, células do útero, células do oviduto, células MDBK.

SUMMARY

The efficiency of three monolayers (continuous lineage - Madin and Darby Bovine Kidney/ MDBK; primary lineage - bovine celisfrom uterus and oviduct) hás been tested to verify the celular specificity through development of two cells embryos until compact morulaes stage in a coculture system without continuous CO₂ flow. The selected mouse embryos (n=343) were randomiy divided into three experimental groups andplaced in closed culture tubes mantained aí 37°C during 72 hours. After the co-culture period, the porcentages of compact morulaes were 87.7% in oviduct cells, 86.2% in uterus monolayer and 88.3% in MDBK cells. It was not observed significative difference between these results and it is possible to condude that celular specificity is not importam to enhance the In vitro development of Mus musculus embryos.

Key words: embryo, Mus musculus, oviduct cells, uterine cells. MDBK cells.

INTRODUÇÃO

A elaboração de um sistema de cocultura de embriões mamíferos que simule um ambiente totalmente compatível ou bastante próximo do ambiente materno é a principal motivação dos pesquisadores visando obter o desenvolvimento in vitro de embriões sem perda de qualidade. Assim, diversos tipos de meio de cultura e, em especial, de monocamadas celulares vêm sendo testados (SAKKAS & TROUNSON, 1990; PEREIRA, 1991; RIBEIRO, 1991; GUERRA, 1992; OLIVEIRA et al. 1996) para eliminar, ou mesmo minimizar os efeitos indesejáveis produzidos pêlos sistemas de cocultura.

A real função da monocamada celular continua indefinida (KIM et al., 1989), entretanto, independentemente da especificidade celular (PEREIRA, 1991; RIBEIRO, 1991), tem-se mostrado indispensável na cocultura de embriões Mus musculus (RIBEIRO, 1991). Essa necessidade pode ser em consequência de proporcionarem estímulos que regulam o metabolismo embrionário (REXROAD Jr., 1989), de fornecerem fatores embriotrófícos ou de removerem substâncias tóxicas ao embrião contidas no meio de cultura (KUZAN & WRIGHT JR., 1982) ou ainda em decorrência de liberarem substâncias altamente lábeis que viabilizam o desenvolvimento in vitro dessas estruturas (KUZAN & WRIGTH JR., 1982), haja visto a necessidade de contato direto entre o embrião e a monocamada celular (BIGGERS et al., 1957; ALLEN & WRIGHT Jr., 1984; RIBEIRO, 1991).

O objetivo deste trabalho foi testar a eficiência de diferentes monocamadas celulares (linhagem contínua - Madin and Darby Bovine Kidney; linhagem primária - células do útero e do oviduto de bovinos) sobre a obtenção de mórulas compactas da espécie Mus musculus após 72 horas de cocultura.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os animais da espécie Mus musculus, submetidos a 14 horas de luz/dia em ambiente a 22°C, receberam ração e água fornecidas ad libitum, além de amendoim e sementes de girassol como complemento alimentar. Os machos foram alojados em gaiolas individuais e as fêmeas (máximo de cinco) em gaiolas coletivas, onde receberam, através de administração intraperitoneal, 10UI de Gonadotropina Coriônica Equina^a (eCG) às 15:00 horas e 10UI de Gonadotropina Coriônica Humana^b (hCG) decorridas 46 horas da aplicação do eCG. Imediatamente após a administração do hCG, as fêmeas eram colocadas nas gaiolas dos machos para acasalamento e na manhã seguinte observava-se a presença de placa vaginal para constatação da cobertura.

Após sacrifício das fêmeas por deslocamento da coluna cervical, os ovidutos juntamente com a porção craneal dos cornos uterinos foram dissecados e acondicionados em placas de petri para que fossem realizadas a lavagem e a colheita das estruturas. Imediatamente após, os embriões no estádio de duas células foram transferidos para um vidro de relógio contendo solução fisiológica acrescida de 20% de soro fetal bovino^c (SFB) com a finalidade de se proceder a avaliação da qualidade embrionária conforme as características morfológicas sugeridas por STRINGFELLOW et al. (1987).

As monocamadas de células do útero e oviduto de bovinos, bem como a de células Madin and Darby Bovine Kidney (MDBK) foram preparadas modificando-se a técnica empregada por SOTOBELOZO et al. (1976) conforme descrito por OLIVEIRA et al (1986). A suplementação do meio de cultura TCM 199/25mM HEPES^d com 20% de soro inativado de vaca no proestro (BRACKETT et al., 1989), foi substituída por 20% de SFB.

Dos embriões colhidos, apenas os classificados como bons ou excelentes (n = 343) foram aleatoriamente distribuídos em tubos de ensaio (máximo de dez estruturas) contendo 2ml de meio de cultura e monocamada celular. Após fechamento hermético desses tubos de ensaio, os embriões foram colocados em estufa bacteriológica^e a 37° C durante 72 horas, período em que foram diariamente avaliados quanto aos aspectos da qualidade e do desenvolvimento.

A influência das diferentes monocamadas de células sobre o desenvolvimento embrionário foi avaliada empregando-se a tabela de contingência (2x3) do teste de QUI-QUADRADO, considerando-se o nível de 5% de signifícância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Esperava-se que as duas monocamadas de células de linhagem primária apresentassem melhor performance sobre o desenvolvimento embrionário do que a de linhagem contínua em decorrência de tomarem o ambiente da cocultura mais compatível com o de origem materna. Sob condições fisiológicas, os embriões de camundongos permanecem no oviduto até os estádios de mórula final e blastocisto inicial (HAFEZ, 1988) e, assim sendo, deveriam sofrer, quando em cocultura, os efeitos benéficos das secre- ções especializadas das monocamadas de células de linhagem primária. Todavia, não foi registrado diferença significativa entre as porcentagens de embriões que alcançaram o estádio de mórula compacta (Tabela 1), resultados contrários aos de GANDOLFI & MOOR (1987) e OVERSKEY & CINCOTA (1987) quando relataram ter verificado que as células de linhagem primária são mais eficientes para a cocultura de embriões.

BIGGERS et al. (1957) e PAUL (1970) não recomendam a utilização da monocamada celular de linhagem contínua para a cocultura de embriões devido esse tipo de célula diferir da monocamada que a originou e REXROAD Jr. (1989) relata que este tipo de monocamada pode comprometer o desenvolvimento embrionário em virtude de sofrer modificação química e morfológica em sua estrutura. Por outro lado, RIBEIRO (1991) após verificar que a monocamada de células MDBK determinava um menor número de embriões degenerados do que a de células uterinas, atribuiu esse achado ao fato das células de linhagem contínua produzirem uma tensão de CO₂ ; mais adequada para manter o pH do meio de cultura em nível desejável. Já PEREIRA (1991) e GUERRA (1992) não registraram diferença entre as performances das monocamadas de linhagem primária e contínua.

Os resultados deste trabalho não evidenciaram também diferença significativa quanto ao número de estruturas degeneradas entre os três grupos experimentais (Tabela 1). É oportuno salientar que tanto nesta pesquisa quanto na de RIBEIRO (1991), o sistema de cocultura empregado tinha o metabolismo celular como única fonte de CO₂. O alto grau de desenvolvimento populacional das células de linhagem contínua relatado por KOSEKI & ABHAB (1979) e justificado por RIBEIRO (1991) como sendo, possivelmente, o responsável pela eficiente produção de CO₂ ; para proporcionar um ambiente mais compatível com o materno, não foi aqui verificado. Talvez, a diferença esteja relacionada com o tipo de meio de cultura utilizado, pois, enquanto RIBEIRO (1991)utilizou o MEM/ EAGLE, nesta pesquisa foi usado o TCM 199/25mM contendo HEPES, substância que tem a finalidade de manter o pH relativamente constante sem suprimento externo de CO₂ (KANE, 1979), impedindo que ocorresse um discrepante número de embriões degenerdos entre as três diferentes monocamadas celulares.

Do mesmo modo que neste experimento, a especificidade celular não foi importante quando as efíciências das monocamadas de linhagem primária e contínua foram comparadas, também não foi ao serem avaliadas as performances das monocamadas de células do útero e de oviduto entre si. Este achado corrobora os dados de PEREIRA (1991), RIBEIRO (1991) e GUERRA (1992) que trabalhando, respectivamente, com embriões de oito células, mórulas e blastocistos e com estruturas de duas células registraram que a especificidade celular é fundamental para o desenvolvimento in vitro de embriões Mus musculus. Entretanto, os resultados aqui obtidos são contrários aos de SAKKAS & TROUNSON (1990) que constataram maior eficiência da monocamada de células de oviduto do que da monocamada de células uterinas na cocultura de zigotos murinos.

É possível admitir que o importante para favorecer o desenvolvimento embrionário, sob condições artificiais, é o contato direto entre o embrião e a monocamada celular como referiram-se BIGGERS et al (1957), BALL et al. (1983), ALLEN & WRIGHT Jr. (1984), e RIBEIRO (1991). Esse contato permite que fatores de crescimento da monocamada celular (BRIGSTOCK et al., 1983) e estímulos que regulam o metabolismo embrionário (REXROAD Jr., 1989) penetrem na zona pelúcida e alcancem a superfície das células embrionárias (ALLEN & WRIGHT Jr., 1984). Outro aspecto importante e que também deve ser levado em consideração é o fato das monocamadas celulares removerem substâncias tóxicas contidas no meio de cultura e de liberarem substâncias altamente lábeis que viabilizam o desenvolvimento embrionário (KUZAN & WRIGHT Jr, 1982).

Tendo em vista que o resultado não evidenciou qualquer diferença significativa entre as performances das monocamadas celulares, conclui-se que, em se tratando da cocultura de embriões Mus musculus a partir do estádio de duas células, tanto pode ser utilizada a monocamada de células de linhagem primária (oviduto ou útero) quanto a de células de linhagem contínua (MDBK).

FONTES DE AQUISIÇÃO

^a Intergonan - Vemie Veterinar Chemie GmbH - RFA.

^b Pregnyl - Laboratório Organon do Brasil Ltda - BR.

^c Cultilab - BR.

^d Sigma Chemical Co. - USA.

^e Fabbe, Primar - BR.

² Médico Veterinário, Professor Assistente (MsC.) do DMV da UFRPE.

³ Médico Veterinário, Professor Adjunto (MsC.) do DMV da UFRPE.

⁴ DVM. PhD, Georgia University. Athens-Georgia, USA.

Recebido para publicação 24.04.96 Aprovado em 21.08.96

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¹

Médico Veterinário, Professor Adjunto MsC., Doutor, Departamento de Medicina Veterinária (DMV) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). Av. D. Manoel de Medeiros, S/N°, Dois Irmãos, 52171-900 - Recife, PE. Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Mar 1997

Histórico

• Recebido
  24 Abr 1996
• Aceito
  21 Ago 1996