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Enzima conversora de angiotensina no líquido pericárdico: estudo comparativo com a atividade sérica

Resumos

FUNDAMENTO: A caracterização de uma enzima conversora de angiotensina (ECA) no líquido pericárdico humano é relevante diante do seu papel na liberação de angiotensina II e, portanto, do papel do pericárdio na homeostase cardivascular. OBJETIVO: Isolar e caracterizar uma ECA do líquido pericárdico humano. Comparar as atividades conversoras de angiotensina I do fluido pericárdico e do soro de pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular. MÉTODOS: A enzima do líquido pericárdico humano foi purificada por meio de etapas cromatográficas e caracterizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), hidrólise de angiotensina I, bradicinina, Hip-His-Leu e substratos sintéticos com supressão interna de fluorescência. Lisinopril foi usado como inibidor. A atividade de ECA foi determinada em amostras de sangue e líquido pericárdico de 23 pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular. RESULTADOS: A ECA purificada (MM = 140 kDa) libera angiotensina II, hidrolisa a bradicinina e o substrato Hip-His-Leu. Os parâmetros cinéticos k cat,(s-1) e k cat/Km (µM-1. s-1) foram respectivamente: Hip-His-Leu (1,14 e 7 x 10 -4), Abz-YRK(Dnp)P-OH (2,60 e 0,77), Abz-LFK(Dnp)-OH (2,77 e 0,36) e Abz-SDK(Dnp)P-OH (1,92 e 0,19). As atividades conversoras de angiotensina I (média ± DP) do líquido pericárdico e no soro foram, respectivamente, 3,16 ± 0,90 mU x mg -1x min-1 e 0,33 ± 0,11 mU x mg -1x min-1 . A diferença foi significativa entre os dois fluidos. CONCLUSÃO: Uma ECA com grande similaridade com a enzima somática foi isolada do fluido pericárdico humano. A atividade conversora de angiotensina I é maior no líquido pericárdico quando comparada com a atividade do soro. Esses dados constituem importante evidência do papel do líquido pericárdico no metabolismo de peptídeos ativos.

Enzima conversora de angiotensina; pericardiocentese; lisinopril; estudo comparativo


BACKGROUND: The characterization of an angiotensin-converting enzyme (ACE) in human pericardial fluid is relevant, considering its role in the angiotensin II release and thus, the role of the pericardium in cardiovascular homeostasis. OBJECTIVE: To isolate and characterize an ACE from human pericardial fluid and to compare the angiotensin I converting activities of the pericardial fluid with that of the serum in patients submitted to cardiovascular surgery. METHODS: The enzyme from human pericardial fluid was purified through chromatographic steps and characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), hydrolysis of angiotensin I, bradykinin, Hip-His-Leu and synthetic substrates with internal fluorescence suppression. Lisinopril was used as inhibitor. The ACE activity was measured in blood and pericardial fluid samples of 23 patients submitted to cardiovascular surgery. RESULTS: The purified ACE (MM = 140 kDa), releases angiotensin II, hydrolyses bradykinin and the Hip-His-Leu substrate. The kinetic parameters k cat,(s-1) and k cat/Km (µM-1. s-1) were, respectively: Hip-His-Leu (1.14 and 7 x 10 -4) ; Abz-YRK(Dnp)P-OH (2.60 and 0.77), Abz-LFK(Dnp)-OH (2.77 and 0.36) and Abz-SDK(Dnp)P-OH (1.92 and 0.19). The angiotensin I converting activities (mean ± SD) in the pericardial fluid and in blood, were, respectively: 3.16 ± 0.90 mU x mg -1x min-1 and 0.33 ± 0.11 mU x mg -1x min-1. The difference was significant between the two fluids. CONCLUSION: An ACE that bears great similarity with the somatic enzyme was isolated from human pericardial fluid. The angiotensin I converting activity is higher in the pericardial fluid when compared to the serum activity. These data are important evidence of the role of the pericardial fluid in the metabolism of active peptides.

Peptidil dipeptidase A; pericardiocentesis; lisinopril; comparative study


ARTIGO ORIGINAL

FISIOLOGIA

Enzima conversora de angiotensina no líquido pericárdico: estudo comparativo com a atividade sérica

Roseli Aparecida da Silva GomesI; Lívia das Graças Vieito Lombardi TeodoroI; Isabel Cristina Rezende LopesI; Patrícia Alessandra BersanettiII; Adriana Karaoglanovic CarmonaII; Valdemar HialI

IUniversidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG- Brasil

IIUniversidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil

Correspondência Correspondência: Roseli Aparecida da Silva Gomes Praça Manoel Terra, 330 - Abadia 38015-050, Uberaba, MG - Brasil E-mail: bioq@dcb.uftm.edu.br

RESUMO

FUNDAMENTO: A caracterização de uma enzima conversora de angiotensina (ECA) no líquido pericárdico humano é relevante diante do seu papel na liberação de angiotensina II e, portanto, do papel do pericárdio na homeostase cardivascular.

OBJETIVO: Isolar e caracterizar uma ECA do líquido pericárdico humano. Comparar as atividades conversoras de angiotensina I do fluido pericárdico e do soro de pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular.

MÉTODOS: A enzima do líquido pericárdico humano foi purificada por meio de etapas cromatográficas e caracterizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), hidrólise de angiotensina I, bradicinina, Hip-His-Leu e substratos sintéticos com supressão interna de fluorescência. Lisinopril foi usado como inibidor. A atividade de ECA foi determinada em amostras de sangue e líquido pericárdico de 23 pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular.

RESULTADOS: A ECA purificada (MM = 140 kDa) libera angiotensina II, hidrolisa a bradicinina e o substrato Hip-His-Leu. Os parâmetros cinéticos kcat,(s-1) e kcat/Km (µM-1. s-1) foram respectivamente: Hip-His-Leu (1,14 e 7 x 10 -4), Abz-YRK(Dnp)P-OH (2,60 e 0,77), Abz-LFK(Dnp)-OH (2,77 e 0,36) e Abz-SDK(Dnp)P-OH (1,92 e 0,19). As atividades conversoras de angiotensina I (média ± DP) do líquido pericárdico e no soro foram, respectivamente, 3,16 ± 0,90 mU x mg -1x min-1 e 0,33 ± 0,11 mU x mg -1x min-1 . A diferença foi significativa entre os dois fluidos.

CONCLUSÃO: Uma ECA com grande similaridade com a enzima somática foi isolada do fluido pericárdico humano. A atividade conversora de angiotensina I é maior no líquido pericárdico quando comparada com a atividade do soro. Esses dados constituem importante evidência do papel do líquido pericárdico no metabolismo de peptídeos ativos.

Palavras-chave: Enzima conversora de angiotensina, pericardiocentese, lisinopril, estudo comparativo.

Introdução

Os estudos com líquido pericárdico têm sido direcionados principalmente para estabelecer o diagnóstico de pericardites, dos derrames pericárdicos e também para o diagnóstico post-mortem1-3. Elevados níveis de substâncias vasoativas e cardioprotetoras são descritos no fluido pericárdico humano4,5. Esse líquido encontra-se numa posição estratégica para receber informações referentes à patologias que envolvem este espaço e o próprio coração. Nosso interesse quanto ao estudo bioquímico do líquido pericárdico tem como alvo algumas enzimas, em especial aquelas que possam servir como marcadores locais de alterações fisiopatológicas. Iniciamos este estudo com uma isoforma da enzima conversora de angiotensina (ECA).

A enzima conversora de angiotensina (ECA) (EC 3.4.15.1) cliva a angiotensina I, formando angiotensina II6, e hidrolisa bradicinina e calidina, gerando fragmentos inativos7. A ECA é uma proteína de membrana descrita no endotélio arterial, nos tecidos epiteliais e neuroepiteliais8-10. Várias isoformas de ECA estão presentes em tecidos de mamíferos. Uma isoforma somática (150-180 kDa), expressa em células endoteliais, epiteliais e neuroepiteliais, possui dois domínios homólogos (N- e C- domínios), cada um com seu próprio sítio catalítico11,12. Outra isoforma de menor massa molecular (90-110 kDa), encontrada exclusivamente nas células germinativas masculinas, contém um único sítio ativo que corresponde ao C-domínio da forma somática13. Formas solúveis da enzima são encontradas em vários líquidos corporais, como sangue, fluido amniótico, sêmen, líquido cefalorraquidiano e urina14-16. No fluido ileal, foi descrita uma forma constituída apenas de N-domínio17. Apesar do alto grau de homologia, os domínios C- e N- da ECA diferem em especificidade de substrato, perfis de inibição e de dependência de cloreto18,19. Os dois sítios ativos clivam angiotensina I, substância P e bradicinina com eficiência similar19. Entretanto, o tetrapeptídeo natural N-acetil-seril-aspartil-lisil-prolina20 e a angiotensina 1-7 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro)21 são mais específicos para o N-domínio catalítico. Peptídeos com supressão interna de fluorescência (peptídeos FRET - fluorescence resonance energy transfer peptides) e contendo seqüências suscetíveis à hidrólise pela ECA têm sido utilizados para caracterização de N- e C- domínios da enzima22-24.

Neste trabalho, apresentamos um estudo de uma isoforma da ECA, isolada pela primeira vez, do líquido pericárdico humano. Comparamos, também neste estudo, as atividades de ECA no fluido pericárdico e no soro de indivíduos submetidos à cirurgia cardiovascular.

Métodos

Reagentes

Angiotensina I, angiotensina II, lisinopril, padrões de massa molecular, bradicinina, o-ftalaldeído, Hip-His-Leu, Mes (ácido 2-[N-morfolino] etanosulfônico), HEPES (ácido N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[2-etanosulfônico]) foram adquiridos da Sigma. Os substratos com supressão interna de fluorescência (peptídeos FRET) Abz-YRK(Dnp)P-OH, Abz-LFK(Dnp)-OH e Abz-SDK(Dnp)P-OH (Abz = ácido o-aminobenzóico; Dnp = 2,4-dinitrofenol) foram sintetizados pelo Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo22-24. Outros reagentes foram de procedência Merck.

Obtenção do líquido pericárdico humano para purificação da enzima conversora de angiotensina (ECA)

O líquido pericárdico foi coletado, até doze horas após o óbito, de indivíduos sem doença cardíaca, durante a necropsia no Serviço de Verificação de Óbito da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba, Minas Gerais. Todas as amostras utilizadas estavam livres de contaminação com sangue.

Obtenção do líquido pericárdico humano e das amostras de sangue para determinação da atividade de enzima conversora de angiotensina (eca)

Líquido pericárdico e amostras de sangue venoso foram coletados de 23 pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM). Amostras de líquido pericárdico foram obtidas da cavidade pericárdica por aspiração através de seringa, durante a abertura da membrana pericárdica para a cirurgia cardíaca. O sangue foi obtido por punção venosa do braço. As amostras de líquido pericárdico e de soro foram centrifugadas (1000 g, 15 minutos) e armazenadas a -20ºC. As amostras de líquido pericárdico não apresentavam contaminação com sangue. Todos os pacientes deram o consentimento informado para participação no estudo. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM (CEP/UFTM) e estão de acordo com a Declaração de Helsinqui.

Purificação da enzima conversora de angiotensina do líquido pericárdico

Líquido pericárdico (65 ml), sem contaminação visível com sangue ou tecido e contendo 1.550 mg de proteína, foi centrifugado a 3.500 rpm, a 4ºC. O sobrenadante foi submetido à ultrafiltração (Amicon, YM-100) para um volume final de 20 ml contendo 780 mg de proteína. O concentrado foi usado para purificação da enzima conversora de angiotensina, após diálise contra tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0. O protocolo de purificação incluiu três etapas cromatográficas:

• Filtração em gel em coluna Superdex 75 HR 10/30, Pharmacia, equilibrada e eluída com tampão fosfato de sódio 0,05 M, contendo NaCl 0,5 M, pH 6,5 e fluxo de 1 ml por minuto. Alíquotas de 0,5 ml foram aplicadas à coluna e coletaram-se frações de 1 ml .

• Cromatografia de afinidade em coluna de Cibacronâ azul agarose, 0,9 x 30 cm, (Bio Rad), equilibrada e eluída com tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0 e fluxo de 0,5 ml/min. Alíquotas de 2,0 ml foram aplicadas e coletaram-se frações de 1 ml.

• Cromatografia de troca iônica em coluna Mono Q 5/5 HR, Pharmacia, equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,5 e eluída por um gradiente de NaCl (0 a 0,5 M) utilizando tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,5 (tampão A) e tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,5, contendo NaCl 0,5 M (tampão B). O fluxo foi mantido em 1 ml/min. Coletaram-se alíquotas de 0,5 ml. Todas as etapas cromatográficas foram monitoradas em 280 nm em espectrofotômetro UV/VIS (Pharmacia).

A atividade enzimática das frações obtidas nas etapas cromatográficas foi testada utilizando-se o substrato Hip-His-Leu, segundo Friedland e Silverstein25. A presença de outras proteínas nas preparações obtidas após cada etapa cromatográfica foi verificada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE - 7,5%) sob condições redutoras, como descrito por Laemmli26 (sistema Bio-Rad). Alíquotas das preparações enzimáticas contendo de 2 a 10 µg de proteína foram aplicadas ao gel. Os géis foram corados pelo método da prata amoniacal27. Para determinação da massa molecular, foram usados padrões de beta-amilase (200 kDa), albumina bovina (65 kDa), anidrase carbônica (29 kDa) e lactalbumina (14 kDa), todos de procedência Sigma. A massa molecular foi estimada por meio de interpolação gráfica.

Determinação das atividades enzimáticas

Hidrólise angiotensina I

Angiotensina I (80 nmoles) em tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,5 (350 µl), contendo NaCl 0,3 M, foi incubada com ECA purificada do líquido pericárdico (4 ng em 10 µl) a 37ºC. Aos 10 e 30 minutos de incubação, alíquotas foram submetidas à cromatografia em coluna de octadecilsilano (C-18), equilibrada em acetonitrila:água deionizada (1:5), contendo 0,1% de ácido trifluoracético (TFA), acoplada a um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, Shimadzu). Realizou-se a eluição com um gradiente feito com acetonitrila:água deionizada (1:5), contendo TFA 0,1% (tampão A) e acetonitrila contendo TFA 0,1% (tampão B). Os peptídeos foram monitorados em 214 nm por espectrofotômetro UV/VIS e identificados através dos tempos de retenção, utilizando angiotensina I e angiotensina II como padrões. O pico correspondente ao padrão de angiotensina II foi testado usando ensaio biológico em útero isolado de rata28. A atividade biológica foi estimada com soluções de concentrações conhecidas de angiotensina I e angiotensina II como padrões. Os ensaios utilizando animais foram desenvolvidos de acordo com as normas estabelecidas pelo Guide for Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, DC) e pelos Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Hidrólise de bradicinina

A bradicinina (BK, 5 nmoles) foi incubada com a enzima conversora purificada do líquido pericárdico (4 ng), em tampão fosfato 0,2 M, pH 7,5 contendo NaCl 0,3 M, para um volume final de 300 µl, a 37ºC, durante 10 minutos e testada em ensaio biológico em útero isolado de rata28. Incubou-se um padrão de BK (5 nmoles) nas mesmas condições, na ausência da enzima e foi utilizado como controle. Uma curva dose-resposta de BK foi utilizada para avaliar quantitativamente a atividade biológica das misturas de incubação anteriormente citadas. O desaparecimento da atividade biológica da BK utilizada foi considerado atividade cininásica. Ensaios de inibição foram realizados usando Na2EDTA (40 mM) e lisinopril (2,5 µM).

Estudos cinéticos

Hidrólise do substrato Hip-His-Leu

A determinação do pH ótimo para hidrólise do substrato Hip-His-Leu foi realizada com os seguintes tampões: glicina-HCl 0,2 M (pH 3,0 a 4,0), acetato de sódio 0,2 M (pH 4,5 a 5,5), fosfato de sódio 0,2 M (pH 6,0 a 7,5), Tris-HCl 0,2 M (pH 8,0 a 8,5) e glicina-NaOH 0,2 M (pH 9,0), contendo NaCl 0,3 M, para um volume final de 490 µL, e a enzima purificada (4 ng). Realizou-se o ensaio como proposto por Friedland e Silverstein25. Os parâmetros cinéticos (kcat and Km) para hidrólise do substrato Hip-His-Leu (0,25 - 3 mM) foram determinados usando a enzima purificada (4 ng) em tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 8,3, contendo NaCl 0,3 M, para um volume final de 490 µl. A mistura foi incubada a 37ºC durante 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 1,2 ml de NaOH 0,34 M, seguida pela adição de 200 µL de HCl 3 M, e o dipeptídeo His-Leu foi quantificado fluorimetricamente (Exc.365 nm; Em. 495 nm) pela formação de um produto fluorescente com 100 µl de uma solução de o-ftalaldeído 150 mM. Os resultados foram expressos como nmol x ml-1 x min-1. Lisinopril (2,5 µM) foi utilizado para os experimentos de inibição.

Hidrólise de Abz-YRK(Dnp)P-OH, Abz-LFK(Dnp)-OH e Abz-SDK(Dnp)P-OH

Os ensaios com substratos com supressão interna de fluorescência foram feitos como descrito previamente22-24. O pH ótimo foi determinado utilizando alíquotas (4 ng) da enzima purificada e uma solução tampão composta de: 25 mM de glicina, 25 mM de ácido acético, 25 mM de Mes e 75 mM de Tris na presença de 100 mM de NaCl e 10 µM de ZnCl2 na faixa de pH de 5,0 a 9,5, para um volume final de 1 ml, a 37ºC. Os parâmetros cinéticos foram determinados a 37ºC, em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) contendo NaCl (0,05 M), ZnCl2 (10 µM) e os substratos Abz-YRK(Dnp)P-OH, Abz-LFK(Dnp)-OH e Abz-SDK(Dnp)P-OH. A atividade enzimática foi continuamente acompanhada por meio de um fluorômetro (Hitachi F-2000) que mediu a fluorescência em 420 nm (λem) após excitação a 320 nm (λexc). A concentração de enzima para determinação da velocidade inicial da reação foi escolhida de tal forma que a hidrólise não fosse superior a 5% do substrato utilizado. A variação de fluorescência foi convertida em micromoles de substrato hidrolisado por minuto, baseando-se numa curva de calibração obtida após a completa hidrólise de cada peptídeo. Os valores de kcat/Km foram calculados a partir dos parâmetros cinéticos kcat e Km obtidos pela análise de regressão linear dos dados com o programa GraFit29. Os desvios padrão para kcat e Km foram inferiores a 7%. A inibição das hidrólises foi realizada utilizando lisinopril (2,5 µM).

Influência de cloretos na atividade catalítica

A influência dos íons cloreto (0 - 500 nM) sobre a atividade catalítica da enzima isolada do fluido pericárdico humano foi investigada utilizando o substrato Abz- YRK(Dnp)P-OH (10 µM) a 37ºC em 1 ml de tampão HEPES 50 mM (pH 7,6) contendo ZnCl2 (10 µM) e 4 ng da enzima. A hidrólise foi acompanhada fluorimetricamente, como descrito anteriormente22.

Atividade conversora de angiotensina no soro e no líquido pericárdico

As atividades conversoras de angiotensina I no soro e no líquido pericárdico foram determinadas utilizando Abz-YRK(Dnp)P-OH (10 µM) - substrato para N e C-domínios da enzima a 37ºC em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,6) contendo NaCl 0,05 M, ZnCl2 10 µM. Cem microlitros das amostras de líquido pericárdico e de soro foram adicionados à solução de substrato para um volume final de 2,0 ml, e a atividade enzimática foi acompanhada fluorimetricamente, como descrito anteriormente22. Uma curva de fluorescência foi obtida com a utilização de padrões de peptídeos antes e após hidrólise total. A atividade enzimática foi expressa como miliunidade por miligrama de proteína por minuto de incubação (mU × mg-1 × min-1). As determinações foram feitas em duplicata. Inibiu-se totalmente a atividade hidrolítica da enzima por lisinopril 2,5 µM. Os dados foram analisados pelo teste t de Student não pareado com um nível de significância de 0,05. As concentrações de proteínas no soro e no líquido pericárdico foram determinadas pelo método do biureto30. Utilizou-se uma solução padrão de proteína nas mesmas condições das amostras e os resultados foram expressos como mg x ml-1.

Resultados

Purificação da ECA do líquido pericárdico

Uma enzima conversora de angiotensina foi purificada até a homogeneidade a partir do líquido pericárdico humano, por meio de uma etapa de filtração em membrana YM-100, para a eliminação de proteínas de massas moleculares inferiores a 100 kDa, e de três etapas cromatográficas, sendo uma de afinidade (Cibacronâ azul agarose), com o intuito de retirar a albumina residual ainda presente no concentrado. A enzima foi purificada cerca de trezentas vezes. Pelo protocolo utilizado, obtiveram-se 200 µg de proteína purificada, com atividade específica de 3.975 nmol His-Leu x mg-1 x min. A eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) mostrou uma única banda protéica sob condições redutoras, com massa molecular aparente de 140 kDa (fig. 1).


A enzima purificada converte angiotensina I em angiotensina II como mostrado pela análise cromatográfica de fase reversa (C18-CLAE) (fig. 2) e pela atividade biológica sobre o útero isolado de rata (fig. 3).



A atividade cininásica da enzima foi demonstrada pelo desaparecimento da atividade biológica da bradicinina sobre o útero isolado de rata, após a incubação com a enzima purificada (fig. 4). Todas as atividades hidrolíticas mostradas pela enzima foram inibidas totalmente por lisinopril.


Os parâmetros cinéticos para a hidrólise dos substratos Hip-His-Leu, Abz-YRK(Dnp)P-OH, Abz-LFK(Dnp)-OH e Abz-SDK(Dnp)P-OH são mostrados na tabela 1.

O efeito do pH na hidrólise do substrato fluorescente AbzYRK(Dnp)P-OH mostrou uma melhor atividade hidrolítica em pH 7,65. A curva obtida é similar ao perfil de hidrólise da enzima nativa para vários substratos.

O efeito da concentração de NaCl na hidrólise do substrato Abz-YRK(Dnp)P-OH foi determinado para avaliar a ativação do C-domínio pelos íons cloreto. A atividade máxima foi observada com NaCl 100 mM e mantida no mesmo nível até 500 mM.

A atividade conversora de angiotensina no soro e no líquido pericárdico de pacientes é mostrada na tabela 2. A análise dos dados mostrou diferença significativa entre os dois fluidos. Quanto ao conteúdo protéico do líquido pericárdico, foi mantida uma relação que variou de 1/2 a 1/3 ao do plasma. Por essa razão, a atividade enzimática foi expressa como atividade específica (mU x mg-1 x min-1).

Condições de ensaio: a atividade de ECA em amostras de líquido pericárdico e no soro de pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular foi determinada utilizando o substrato Abz-YRK(Dnp)P-OH (10 µM) a 37ºC , em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7.0), contendo NaCl 0,05 M e ZnCl 10 µM, em volume final de 2,0 ml. Abz = ácido o-aminobenzóico; Dnp = 2,4-dinitrofenol. Os ensaios foram feitos em duplicata. O teor de proteína foi determinado pelo método do biureto. DP = desvio padrão da média; *p < 0,05, #p < 0,05, comparado com o soro.

Discussão e conclusão

No presente estudo, isolamos e caracterizamos, pela primeira vez, uma enzima conversora de angiotensina do líquido pericárdico humano. A massa molecular (140 kDa) obtida por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida, para a isoforma isolada, mostrou ser diferente quando comparada aos dados da literatura, em que são descritas massas moleculares nas regiões de 90-110 e 150-180 kDa12-14. Essa diferença poderia ser decorrente de modificações pós-traducionais, tais como clivagens da cadeia polipeptídica e/ou glicosilação na isoforma do líquido pericárdico.

Nossos dados mostram que a enzima hidrolisa o substrato clássico para enzima conversora de angiotensina-I, Hip-His-Leu, cliva a ligação Phe-His na angiotensina I, gerando angiotensina II, e apresenta atividade cininásica, hidrolisando bradicinina a produtos inativos. Essas observações indicam que a enzima aqui isolada exibe grande similaridade hidrolítica com a enzima somática. Com o intuito de melhor caracterizar a enzima do líquido pericárdico humano, ensaios com substratos sintéticos suscetíveis à hidrólise pelos domínios C- e N- da ECA foram utilizados, e os resultados obtidos mostram que a isoforma isolada apresenta os dois sítios ativos como a ECA somática. O efeito de íons cloreto sobre a atividade catalítica mostrou um perfil de ativação muito similar à isoforma nativa23. Com relação às constantes catalíticas obtidas para a enzima purificada, utilizando os vários substratos sintéticos, observamos dados para Km, similares àqueles encontrados para a forma recombinante. Entretanto, os dados obtidos para kcat/Km mostram que a enzima do líquido pericárdico apresenta menor eficiência catalítica que a forma recombinante23. A inibição de todas as atividades hidrolíticas testadas utilizando lisinopril reforçou o caráter de enzima conversora de angiotensina da isoforma aqui isolada.

Nossos achados tornam-se mais relevantes por tratar-se do líquido pericárdico humano, pois é sabido que estudos realizados in vitro no miocárdio de diferentes espécies mostram que a ECA constitui a principal via formadora de angiotensina II, constituindo exceção a esta regra o coração humano, do hamster e do cão. Em razão disso, redobrada cautela deve ser tomada ao se estenderem para o coração humano os dados colhidos em outras espécies31.

O endotélio tem sido considerado a principal fonte de ECA no coração normal32,33. Entretanto, estudos experimentais têm mostrado uma forte marcação para ECA no pericárdio visceral fibrosado, tanto em miocárdio pós-infarto quanto no grupo-controle em que foi feita apenas a abertura da membrana pericárdica, sugerindo que o tecido fibrosado cardíaco pode ser uma fonte de angiotensina II34.

A possibilidade de síntese e secreção de macromoléculas pela camada mesotelial do pericárdio pode ser amparada pelos dados obtidos por Ishihara e cols.35 que observaram junções intercelulares entre células mesoteliais adjacentes, que constituem barreiras à livre difusão de macromoléculas entre o sangue e a cavidade pericárdica36.

Com o mesmo substrato suscetível aos domínios C- e N- da ECA, utilizado para caracterizar a isoforma isolada neste estudo, realizamos ainda um estudo comparativo para determinar a atividade conversora de angiotensina I no líquido pericárdico e no plasma, mostrando que a atividade no líquido pericárdico é maior que aquela do plasma. Isso corrobora a hipótese de uma isoforma de origem local, com propriedades hidrolíticas similares à ECA plasmática, não excluindo a possibilidade da presença de outras isoformas. O líquido pericárdico é um ultrafiltrado do plasma através do miocárdio, e é pouco provável que a isoforma isolada em nosso estudo tenha origem plasmática, uma vez que o processo de difusão está limitado a moléculas com massas moleculares menores que 40 kDa. É mais provável que ela se origine de células no interior do pericárdio ou da camada mesotelial.

Não devemos, portanto, considerar o pericárdio uma simples bolsa em cujo interior existe uma pequena quantidade de um líquido lubrificante. A presença de enzima conversora de angiotensina I na interface líquido pericárdico-miocárdio constitui importante evidência do papel do pericárdio na regulação da homeostase cardiovascular. É possível que parte dos efeitos da angiotensina II sobre o coração seja decorrente de sua produção pericárdica.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado por CNPq.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Mestrado de Isabel Cristina Rezende Lopes pela Universidade Federal do Triângulo Mineiro.

Artigo enviado em 26/11/07; revisado recebido em 14/2/08; aceito em 15/2/08.

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  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      01 Out 2008
    • Data do Fascículo
      Set 2008

    Histórico

    • Aceito
      15 Fev 2008
    • Revisado
      14 Fev 2008
    • Recebido
      26 Nov 2007
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