EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE PROBIÓTICOS NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUTÂNEAS EM RATOS

Eliane TAGLIARI Leticia Fuganti CAMPOS Antonio Carlos CAMPOS Thaís Andrade COSTA-CASAGRANDE Lúcia de NORONHA Sobre os autores

ABSTRACT

Background:

Manipulating intestinal microbiota with probiotics might stimulate skin response. Understanding all stages of the healing process, as well as the gut-skin-healing response can improve the skin healing process.

Aim:

To evaluate the effect of perioperative oral administration of probiotics on the healing of skin wounds in rats.

Methods:

Seventy-two Wistar male adult rats were weighed and divided into two groups with 36 each, one control group (supplemented with oral maltodextrin 250 mg/day) and one probiotic group (supplemented with Lactobacillus paracasei LPC-37, Bifidobacterium lactis HN0019, Lactobacillus rhamnosus HN001, Lactobacillus acidophilus NCFM® at a dose of 250 mg/day), both given orally daily for 15 days. The two groups were subsequently divided into three subgroups according to the moment of euthanasia: in the 3rd, 7th and 10th postoperative days.

Results:

There were no significant changes in weight in both groups. Wound contraction was faster in probiotic group when compared to the controls, resulting in smaller wound area in the 7th postoperative day. As for histological aspects, the overall H&E score was lower in the probiotic group. The probiotic group showed increased fibrosis from 3rd to the 7th postoperative day. The type I collagen production was higher in the probiotic group at the 10th postoperative day, and the type III collagen increased in the 7th.

Conclusion:

The perioperative use of orally administrated probiotic was associated with a faster reduction of the wound area in rats probably by reducing the inflammatory phase, accelerating the fibrosis process and the deposition of collagen.

HEADINGS:
Probiotics; Wound healing; Rats; Administration, oral

RESUMO

Racional:

Manipular a microbiota intestinal parece auxiliar na resposta cutânea. Entender todas as etapas do processo de cicatrização, bem como a resposta intestino-pele-cicatrização, pode ser ferramenta complementar no reparo cutâneo.

Objetivo:

Avaliar o efeito de suplementação perioperatória de probióticos via oral na cicatrização de feridas cutâneas excisionais em ratos.

Métodos:

Setenta e dois ratos adultos, machos Wistar, foram divididos em dois grupos de 36, sendo um de controle (suplementado com maltodextrina 250 mg/dia) e outro probiótico (suplementado com Lactobacillus paracasei LPC-37, Bifidobacterium lactis HN0019, Lactobacillus Rhamnosus HN001, Lactobacillus Acidophilus NCFM®, 250 mg/dia).

Resultados:

Não houve modificação significativa de peso em ambos os grupos. A contração da ferida foi mais rápida no grupo probiótico, quando comparada ao controle, resultando em menor área cruenta no sétimo dia do pós-operatório. Quanto aos aspectos histológicos, o escore geral do HE foi menor no grupo probiótico. O grupo probiótico apresentou maior fibrose do terceiro ao sétimo dias pós-operatórios. A produção de colágeno tipo I foi maior no grupo probiótico no décimo dia pós-operatório, e do tipo III maior no sétimo.

Conclusão:

O uso perioperatório do probiótico via oral foi associado à redução mais rápida da área cruenta da ferida cutânea em ratos, possivelmente por reduzir a fase inflamatória, acelerando a fibrose e o processo de deposição de colágeno.

DESCRITORES:
Cicatrização; Administração oral; Probióticos; Ratos

INTRODUÇÃO

A pele é um ecossistema variado composto por 1,8 m2 de tecido que recobre todo o corpo, rica em dobras, anexos cutâneos e contém microbiota diversificada1111 Komatsu N, Saijoh K, Sidiropoulos M, Tsai B, Levesque M, Elliott M et al. Quantification of Human Tissue Kallikreins in the Stratum Corneum: Dependence on Age and Gender. Journal of Investigative Dermatology. 2005;125(6):1182-1189.. Recentemente, análises moleculares avançadas da microbiota cutânea revelaram grande diversidade e estas variam de acordo com localização topográfica sobre o corpo77 Dethlefsen L, McFall-Ngai M, Relman D. An ecological and evolutionary perspective on human-microbe mutualism and disease. Nature. 2007;449(7164):811-818.. A cicatrização é processo celular dinâmico que envolve eventos moleculares e bioquímicos visando a reconstituição tecidual33 Campos A, Borges-Branco A, Groth A. Cicatrização de feridas. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2007;20(1):51-58.,44 Campos A, Groth A, Branco A. Assessment and nutritional aspects of wound healing. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 2008;11(3):281-288.. A cicatrização pode ser avaliada com parâmetros clínicos, mecânicos, bioquímicos e histológicos33 Campos A, Borges-Branco A, Groth A. Cicatrização de feridas. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2007;20(1):51-58.,44 Campos A, Groth A, Branco A. Assessment and nutritional aspects of wound healing. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 2008;11(3):281-288.. A microbiota da pele também exerce papel fundamental na resposta imune cujas alterações na imunidade inata dela podem interferir na cicatrização de feridas2020 Radek, K. and Gallo, R. (2010). Amplifying Healing: The Role of Antimicrobial Peptides in Wound Repair. Advances in Wound Care, 1, pp.223-229.. A percepção da pele como um ecossistema rico em componentes biológicos vivos e presentes em diferentes locais, explica o delicado equilíbrio entre hospedeiro e micro-organismos. A microbiota cutânea sofre influência da microbiota intestinal e esta também tem demonstrado interagir com o hospedeiro de forma simbiótica, modulando a inflamação e o sistema imunológico, agindo na biotransformação de xenobióticos e na absorção de micronutrientes, sintetizando vitaminas, enzimas e proteínas usadas pelo hospedeiro, fermentando substratos energéticos, fornecendo resistência a patógenos e mudando a quantidade de energia disponível na dieta2626 Wagner N, Zaparolli M, Cruz M, Schieferdecker M, Campos A. Postoperative Changes in Intestinal Microbiota and use of Probiotics in Roux-en-y Gastric Bypass and Sleeve Vertical Gastrectomy: an Integrative Review. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2018;31(4).. A manipulação da cicatrização com o uso de probióticos tem sido estudada tanto para uso tópico quanto sistêmico. Os probióticos são colocados pela Organização Mundial de Saúde como “microrganismos vivos, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefício à saúde do hospedeiro88 Flesch A, Poziomyck A, Damin D. The therapeutic use of symbiotics. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2014;27(3):206-209.,2424 Tagliari E, Campos A, Costa-Casagrande T, Salvalaggio P. The Impact of the Use of Symbiotics in the Progression of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in a Rat Model. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2017;30(3):211-215.,2626 Wagner N, Zaparolli M, Cruz M, Schieferdecker M, Campos A. Postoperative Changes in Intestinal Microbiota and use of Probiotics in Roux-en-y Gastric Bypass and Sleeve Vertical Gastrectomy: an Integrative Review. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2018;31(4).,2929 World Gastroenterology Organization (WGO), Probiotics and prebiotics. 2017. Available from: http://www.worldgastroenterology.org/guidelines/global-guidelines/probiotics-and-prebiotics/probiotics-and-prebiotics-english [Accessed 16th July 2019]
http://www.worldgastroenterology.org/gui...
. Probióticos têm sido associados com melhora da cicatrização de úlceras intestinais e cicatrização de feridas cutâneas entre outras ações já descrita na literatura2020 Radek, K. and Gallo, R. (2010). Amplifying Healing: The Role of Antimicrobial Peptides in Wound Repair. Advances in Wound Care, 1, pp.223-229..

O objetivo do estudo foi analisar o efeito da administração oral de probióticos na cicatrização cutânea em ratos. mediante aspectos macroscópicos, histológicos e deposição do colágeno da ferida.

MÉTODOS

O estudo fez parte da linha de pesquisa em Cicatrização de Tecidos do Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica da Universidade Federal do Paraná - UFPR. Os experimentos com animais foram realizadas de acordo com as normas previstas na Lei Federal nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, normas previstas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) após aprovação da Comissão de Ética do uso de Animais (CEUA) da Universidade Positivo (Parecer de número 294).

Animais e administração do probiótico

Durante todo o experimento os animais foram acondicionados em caixas de polipropileno apropriadas, com cama de cepilho, recebendo água e ração Presence®-Purina ad libitium. Foram alojados dois animais por caixa, mantidos em sala climatizada em temperatura de 21° C, com controle de umidade e expostas à luminosidade de 12 h de luz por dia, controlada automaticamente. Foram utilizados 72 ratos adultos, machos Wistar, pesando +250 g, procedentes do biotério da Universidade Positivo. Os ratos foram pesados e divididos em dois grupos com 36 animais cada, sendo um grupo controle (suplementado com maltodextrina 250 mg/dia) e um grupo probiótico (suplementados com probiótico Probiatop® da FQM-FARMA composto com cepas Lactobacillus paracasei LPC-37, Bifidobacterium lactis HN0019, Lactobacillus rhamnosus HN001, Lactobacillus acidophilus NCFM®, na dose de 250 mg/dia, o que corresponde a dose aproximada de 200.000 a 210.000 UFC (unidades formadoras de colônias), administrado via oral, 1 vez ao dia com auxílio de uma espátula2424 Tagliari E, Campos A, Costa-Casagrande T, Salvalaggio P. The Impact of the Use of Symbiotics in the Progression of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in a Rat Model. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2017;30(3):211-215. misturado com requeijão cremoso. Os dois grupos foi subdivididos em três sub grupos de acordo com o momento da eutanásia em 30 pós-operatório (3PO), 70 pós-operatório (7PO) e 100 pós-operatório (10PO), com 12 ratos cada.

Procedimento cirúrgico

Após cinco dias de adminstração oral pré-operatória do probiótico ou maltodextrina, os ratos foram anestesiados e submetidos a uma ferida dorsal excisional quadrada, padronizada por molde medindo 2x2 cm. A anestesia foi via inalatória (isoflurano) e mantidos com associação de cloridrato de ketamina 80 mg|kg e cloridrato de xilasina 10 mg|kg por via intramuscular, sendo mantidos sob o efeito inalatório do anestésico durante todo procedimento. Após recuperação, retornaram às suas gaiolas de origem recebendo água e alimentação ad libitum. Para analgesia foi utilizado acetominofeno líquido em dose diária de 200 mg/kg/dia por via oral, até o 4o dia de pós-operatório. Foram avaliados nos dias 3PO, 7PO e 10PO (Figura 1).

FIGURA 1
Desenho do estudo

As feridas foram fotografadas a uma distância padronizada, apoiando-se a câmera fotográfica sobre régua de 15 cm. A análise e o cálculo das áreas, em milímetros quadrados, foram realizados pelo programa Image-Pro® Plus (versão 4.5. Media Cybernetics, Rockville, Maryland, USA).

Eutanásia e coleta de materiais

No 30PO (C3 e P3), 70PO (C7 e P7) e 10ºPO(C10 e P10) dia pós-operatório, os ratos foram submetidos à eutanásia também em sistema fechado com isoflurano. Imediatamente após morte, as lesões foram excisadas e incluíram toda a extensão da ferida com margem de 1 cm de pele íntegra e armazenadas em frascos, com formol a 10%, a fim de preservar suas estruturas morfológicas para posterior estudo histológico e densitometria do colágeno.

Análise histológica

As peças foram cortadas em blocos em micrótomo rotativo, com cortes de 5 micrômetros de espessura. Para cada ferida, foi confeccionada uma lâmina histológica com 3-6 cortes. Os cortes foram executados em plano perpendicular à superfície da derme, na região central e nas bordas da ferida cirúrgica e submetidas aos processos de desidratação e diafanização em xilol, e coradas com H&E. A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico Olympus BX40 (Tóquio, Japão), com magnificações de 20x. Na leitura, foram avaliados tipos e quantidade das células predominantes na reação inflamatória (neutrófilos), presença de edema intersticial e congestão vascular e o grau de formação de tecido de fibroblastos, neovasos e macrófagos. Os dados foram classificados em acentuado (3), moderado (2) e discreto (1), de acordo com a intensidade em que foram encontrados, e transformados em variáveis quantitativas por meio da atribuição de índice aos achados histológicos. A presença de edema, congestão e polimorfonucleares, foram indicativos de processo inflamatório agudo, pontuando negativamente, e a formação de fibroblastos, neovasos e monócitos foram achados indicativos de processo inflamatório crônico, pontuando positivamente. Após a atribuição dos índices, eles foram somados para totalizar escore final para posterior avaliação estatística entre os grupos estudados2525 Vizzotto Junior A, Noronha L, Scheffel D, Campos A. Influência da cisplatina administrada no pré e no pós-operatório sobre a cicatrização de anastomoses colônicas em ratos. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. 2003;39(2):143-149..

Densitometria do colágeno

Lâminas histológicas foram coradas com Picrosirius-red F3BA e fotografadas sendo que cada imagem foi capturada com luz normal e polarizada. Foram selecionados quatro campos por ferida, de forma padronizada, sendo dois da borda e dois da área central da ferida, sempre de cima para baixo. Foi realizada transmissão da imagem do microscópio ScopeA1® (Zeiss, Alemanha) conectado à câmera digital AxioCam MRc (Zeiss, Alemanha) para um monitor colorido HP ZR2440W. As imagens foram registradas pelo Software AxioVision 4.9 (Zeiss, Alemanha) Image Pro-plus e analisadas pelo software Image-Pro Plus® 4.5; (Media Cybernetics, Rockville, Maryland, Estados Unidos). No sistema RGB (Red, Green, Blue) as fibras colágenas mais espessas e fortemente birrefringentes apresentam-se coradas em vermelho-alaranjado (colágeno tipo I, maduro), e as fibras mais finas, dispersas, fracamente birrefringentes, coram-se de tons verdes (colágeno tipo III, imaturo).

Análise estatística

Os resultados foram descritos por médias, medianas, valores mínimos, valores máximos e desvios-padrão. Para a comparação entre os grupos, em cada dia de avaliação, foi usado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. As comparações entre os dias de avaliação, dentro dos grupos controle e probiótico, foram feitas usando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Valores de p<0,05 indicaram significância estatística. Os dados foram organizados em planilha Excel e analisados com o programa computacional IBM SPSS Statistics®, v.20.

RESULTADOS

Durante todo o experimento, não houveram óbitos. O peso corporal não apresentou alterações significativas em nenhum grupo durante todo o experimento dia -5 (3PO p=0.150; 7PO p=0.410; 10PO p=0.107), dia 0 (3PO p=0.867; 7PO p=0.851; 10PO p=0.185), dia 3PO (3PO p=0.741; 7PO p=0.599; 10PO p=0.629), dia 7PO ( 7PO p=0.730; 10PO p=0.549) e dia 10PO (10PO p=0.937).

Análise histológica

Na Figura 2A são mostrados os resultados para os indicadores histológicos da reação inflamatória. Para as variáveis edema, congestão e polimorfonucleares, não houve diferença quando comparados os grupos controle e probiótico em todos os tempos analisados. A fibrose no 7PO foi significativamente maior no grupo probiótico quando comparado com o controle (p=0.028). Para as variáveis neovasos e monócitos, não houve diferença significativa entre os grupos. Ainda na Figura 2B pode-se ver que o score geral do H&E foi melhor no grupo probiótico quando comparado com o controle no 3PO (p=0.017) e no 7PO (p=0.014). Figura 3 demonstra exemplos da evolução histológica (edema, congestão, polimorfosnucleares, fibrose, neovasos e monócitos) entre controle e probiótico, nos dias 3PO, 7PO e 10 PO. Observou-se que o grupo probiótico apresentou menos edema, congestão e polimorfosnucleares e a contagem dos monócitos foi equivalente.

FIGURA 2
Nos tempos 3PO, 7PO e 10PO entre os grupos controle (C) e probiótico (P): A) gráfico mostrando a quantidade de fibrose; B) gráfico mostrando evolução histológica celular; C) gráfico mostrando a área do tecido da ferida (mm2), nos tempos 3PO, 7PO e 10PO.

FIGURA 3
Evolução histológica (edema, congestão, polimorfonucleares, fibrose, neovascularização e monócitos) entre controle e probiótico: A e B) 3PO A=controle, B=probiótico; C e D) 7PO C=controle; D=probiótico); E e F) 10PO E=controle e F=probiótico

Análise do colágeno

Tabela 1 mostra os resultados da avaliação da deposição dos colágenos tipo I e tipo III, na ferida. O tipo I foi maior no grupo probiótico no 10PO (p=0.007), quando comparado com o controle. Houve aumento do colágeno tipo III no 7PO (p=0.014) no grupo probiótico quando comparado com o grupo controle. Na Figura 4 a distribuição dos colágenos tipo I e tipo III é mostrada nos tempos 3PO, 7PO e 10PO, para os grupos controle e probiótico.

TABELA 1
Avaliação de colágeno I e colágeno III (na área total), expressos em mm2, nos grupos controle e probiótico, nos tempos 3PO, 7PO e 10PO

FIGURA 4
Exemplo de evolução histológica (edema, congestão, polimorfonucleares, fibrose, neovascularização e monócitos) em ambos os grupos controle e probiótico nos dias 3PO (A e B), 7PO (C e D) e 10PO (E e F)

Área cruenta da ferida

Conforme descrito na Figura 2C, a contração da ferida foi maior no grupo probiótico no 7PO quando comparado com o controle, resultando em menor área cruenta (43,4±5,2 vs. 47,2±4,9 mm2; p=0.013). Como mostrado na Figura 4, a evolução da contração da ferida foi mais rápida no grupo probiótico em comparação aos controle.

DISCUSSÃO

Probióticos e seus metabólitos são consideradas reguladores de várias funções biológicas, e seus efeitos estão sendo estudados no eixo intestino-pele, controlando a cicatrização de feridas77 Dethlefsen L, McFall-Ngai M, Relman D. An ecological and evolutionary perspective on human-microbe mutualism and disease. Nature. 2007;449(7164):811-818.. Probióticos podem ser usados via tópica ou sistêmica. Muitos estudos relacionam os benefícios dos probióticos topicamente, demonstrando melhora na cicatrização de feridas através da redução da carga bacteriana e aumento da reparação tecidual em modelos de ferida de roedores1616 Lukic J, Chen V, Strahinic I, Begovic J, Lev-Tov H, Davis S et al. Probiotics or pro-healers: the role of beneficial bacteria in tissue repair. Wound Repair and Regeneration. 2017;25(6):912-922.. Os efeitos sistêmicos dos probióticos promovem a ligação entre a microbiota intestinal e a cutânea, diminuem a inflamação, alteram a composição da microbiota em ambos os locais e regulam o sistema imune inato2828 WILGUS T. Immune cells in the healing skin wound: Influential players at each stage of repair. Pharmacological Research. 2008;58(2):112-116.. Ainda o uso oral melhora a microbiota intestinal e absorção de nutrientes essenciais na cicatrização de feridas, como vitaminas, minerais e cofatores para enzimas chaves na regulação da cicatrização cutânea1616 Lukic J, Chen V, Strahinic I, Begovic J, Lev-Tov H, Davis S et al. Probiotics or pro-healers: the role of beneficial bacteria in tissue repair. Wound Repair and Regeneration. 2017;25(6):912-922.,2828 WILGUS T. Immune cells in the healing skin wound: Influential players at each stage of repair. Pharmacological Research. 2008;58(2):112-116..

Scotti et al2323 Scotti E, Boué S, Sasso G, Zanetti F, Belcastro V, Poussin C et al. Exploring the microbiome in health and disease. Toxicology Research and Application. 2017;1:239784731774188.. mostrou em sua revisão que as diferenças na composição microbiana do intestino podem afetar a homeostase da extração de energia, o que pode implicar no ganho ou perda de peso no hospedeiro quando suplementado com probiótico. Neste estudo, não houve diferença de peso nos dias avaliados em todos os grupos.

A cicatrização de feridas é processo altamente dinâmico que envolve sequência complexa de eventos celulares e bioquímicos que variam desde uma resposta imediata ao dano celular da pele e sinais microbianos invasivos até respostas inflamatórias, angiogênicas e, finalmente, fibroplasia e formação de cicatriz33 Campos A, Borges-Branco A, Groth A. Cicatrização de feridas. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2007;20(1):51-58.,44 Campos A, Groth A, Branco A. Assessment and nutritional aspects of wound healing. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 2008;11(3):281-288.,2121 Salgado F, Artigiani-neto R, Lopes-filho G. Growth Factors and Cox2 in Wound Healing: an Experimental Study with Ehrlich Tumors. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2016;29(4):223-226.,2828 WILGUS T. Immune cells in the healing skin wound: Influential players at each stage of repair. Pharmacological Research. 2008;58(2):112-116.. Os fenômenos acontecem simultaneamente, se autorregulam e interferem um no outro envolvendo três fases dinâmicas: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de remodelamento44 Campos A, Groth A, Branco A. Assessment and nutritional aspects of wound healing. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 2008;11(3):281-288.,55 Castilho T, Campos A, Mello E. Effect of Omega-3 Fatty Acid in the Healing Process of Colonic Anastomosis in Rats. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2015;28(4):258-261.,2929 World Gastroenterology Organization (WGO), Probiotics and prebiotics. 2017. Available from: http://www.worldgastroenterology.org/guidelines/global-guidelines/probiotics-and-prebiotics/probiotics-and-prebiotics-english [Accessed 16th July 2019]
http://www.worldgastroenterology.org/gui...
. A interação entre inflamação, respostas celulares e humorais com intensa produção e liberação de citocinas é fundamental para o próprio processo de cicatrização33 Campos A, Borges-Branco A, Groth A. Cicatrização de feridas. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2007;20(1):51-58.,44 Campos A, Groth A, Branco A. Assessment and nutritional aspects of wound healing. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 2008;11(3):281-288.,2121 Salgado F, Artigiani-neto R, Lopes-filho G. Growth Factors and Cox2 in Wound Healing: an Experimental Study with Ehrlich Tumors. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2016;29(4):223-226.. O presente estudo descreve um modelo de cicatrização cutânea excisional em ratos, com o objetivo de avaliar o efeito da administração oral de probiótico na cicatrização de feridas cutâneas. Avaliações macroscópicas e microscópicas das feridas cutâneas em ratos foram realizadas em três momentos distintos: 3PO, 7PO e 10PO.

Neutrófilos são as primeiras células recrutadas para o local da lesão. A principal função delas é proteger o hospedeiro de infecção combatendo micro-organismos invasores e/ou removendo detritos celulares, bem como a apresentação de antígenos. No entanto, neutrófilos ativados secretam substâncias bioativas, como proteases e radicais livres, que em excesso, podem levar a danos teciduais55 Castilho T, Campos A, Mello E. Effect of Omega-3 Fatty Acid in the Healing Process of Colonic Anastomosis in Rats. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2015;28(4):258-261.,2828 WILGUS T. Immune cells in the healing skin wound: Influential players at each stage of repair. Pharmacological Research. 2008;58(2):112-116.. A seguir os queratinócitos migram para a derme ferida e proliferam formando o tecido de granulação que tem por finalidade restaurar a função de barreira da pele. Fibroblastos invadem o coágulo e ocorre angiogênese seguida da remodelação de tecidos, controlada pelos fibroblastos que produz colágeno e forma a cicatriz55 Castilho T, Campos A, Mello E. Effect of Omega-3 Fatty Acid in the Healing Process of Colonic Anastomosis in Rats. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2015;28(4):258-261.,1717 Nery R, Kahlow B, Skare T, Tabushi F, Castro A. Uric Acid and Tissue Repair. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2015;28(4):290-292..

Muitas funções de monócitos e macrófagos foram ligados à ativação de receptores Toll-like (TLRs)1212 Lai Y, Di Nardo A, Nakatsuji T, Leichtle A, Yang Y, Cogen A et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nature Medicine. 2009;15(12):1377-1382.,1313 Lai Y, Gallo R. Toll-Like Receptors in Skin Infections and Inflammatory Diseases. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008;8(3):144-155.,1515 Lin Q, Wang L, Lin Y, Liu X, Ren X, Wen S et al. Toll-Like Receptor 3 Ligand Polyinosinic:Polycytidylic Acid Promotes Wound Healing in Human and Murine Skin. Journal of Investigative Dermatology. 2012;132(8):2085-2092.,1818 Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes and Infection. 2004;6(15):1382-1387.. A resposta à lesão da pele em animais é desencadeada por padrões moleculares associados ao dano derivado do hospedeiro e à ativação de células inflamatórias1313 Lai Y, Gallo R. Toll-Like Receptors in Skin Infections and Inflammatory Diseases. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008;8(3):144-155.. Os achados do processo inflamatório agudo como edema intersticial e congestão vascular, têm ligação menos estreita com o processo de proliferação celular, enquanto que o processo inflamatório crônico está histologicamente relacionado ao infiltrado polimorfonuclares, tecido de granulação e fibrose2525 Vizzotto Junior A, Noronha L, Scheffel D, Campos A. Influência da cisplatina administrada no pré e no pós-operatório sobre a cicatrização de anastomoses colônicas em ratos. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. 2003;39(2):143-149.. Fibrose é definida como o depósito de fibra intersticial que marca o início da cicatriz.

A fase proliferativa, marcada pela presença de fibrose foi maior grupo probiótico no dia 7PO, quando comparado com o controle, resultando em menor área cruenta naquele momento. Provavelmente, o uso de probiótico estimulou a deposição de colágeno e facilitou a fibrose, melhorando o processo de cicatrização. A quantidade de colágeno no dia 7PO no grupo probiótico foi equivalente àquela observada nos controles no dia 10PO. Ao analisar o escore geral do H&E, espera-se que na fase inicial (3PO) as pontuações sejam negativas, mas no grupo probiótico estas foram menos negativas. Aos sete dias (7PO), quando a fase subaguda se inicia, o escore do grupo probiótico já era positivo, mostrando uma resolução mais rápida do processo de cicatrização no grupo probiótico quando comparado ao grupo controle. No 10PO o grupo probiótico mostrou sinais de estabilização da fase de cicatrização crônica e sinais de remodelação da matriz.

A redução da área da ferida foi mais rápida no grupo probiótico. Ao comparar a contração da área da ferida, proliferação de fibroblastos e evolução histológica, fica claro que o grupo suplementado com probiótico teve uma melhor resolução do processo de cicatrização.

O mecanismo possivelmente envolvido neste processo está relacionado com o papel dos receptores Toll-like (TLRs)1212 Lai Y, Di Nardo A, Nakatsuji T, Leichtle A, Yang Y, Cogen A et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nature Medicine. 2009;15(12):1377-1382.,1313 Lai Y, Gallo R. Toll-Like Receptors in Skin Infections and Inflammatory Diseases. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008;8(3):144-155.,1515 Lin Q, Wang L, Lin Y, Liu X, Ren X, Wen S et al. Toll-Like Receptor 3 Ligand Polyinosinic:Polycytidylic Acid Promotes Wound Healing in Human and Murine Skin. Journal of Investigative Dermatology. 2012;132(8):2085-2092.,1818 Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes and Infection. 2004;6(15):1382-1387.,2222 Sato T, Yamamoto M, Shimosato T, Klinman D. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair and Regeneration. 2010;18(6):586-593.. Os tecidos epiteliais de revestimento externo e interno expressam TLRs, como a pele e o intestino. A microbiota comensal deles expressa peptídeos antimicrobianos (AMPs)1313 Lai Y, Gallo R. Toll-Like Receptors in Skin Infections and Inflammatory Diseases. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008;8(3):144-155.,1515 Lin Q, Wang L, Lin Y, Liu X, Ren X, Wen S et al. Toll-Like Receptor 3 Ligand Polyinosinic:Polycytidylic Acid Promotes Wound Healing in Human and Murine Skin. Journal of Investigative Dermatology. 2012;132(8):2085-2092.. Os AMPs também estimulam e aumentam as vias de TLRs, induzem a produção de quimiocinas com atividade quimiotática e ainda modulam a função de células dendríticas e linfócitos T para promover a cicatrização de feridas e manter a homeostase da barreira da pele1212 Lai Y, Di Nardo A, Nakatsuji T, Leichtle A, Yang Y, Cogen A et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nature Medicine. 2009;15(12):1377-1382.,1313 Lai Y, Gallo R. Toll-Like Receptors in Skin Infections and Inflammatory Diseases. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008;8(3):144-155.,1515 Lin Q, Wang L, Lin Y, Liu X, Ren X, Wen S et al. Toll-Like Receptor 3 Ligand Polyinosinic:Polycytidylic Acid Promotes Wound Healing in Human and Murine Skin. Journal of Investigative Dermatology. 2012;132(8):2085-2092.,1818 Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes and Infection. 2004;6(15):1382-1387.. A expressão de TLR em neutrófilos, fibroblastos, monócitos e macrófagos é primordial para a resposta cicatricial1818 Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes and Infection. 2004;6(15):1382-1387.,2222 Sato T, Yamamoto M, Shimosato T, Klinman D. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair and Regeneration. 2010;18(6):586-593.. O aparecimento de ligantes de TLRs indica alteração na integridade do tecido, o que requer contenção e reparo. Animais deficientes em TLRs apresentaram atraso na cicatrização de feridas, sobretudo no tocante ao processo de neovascularização, re-epitelização e fibrose1818 Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes and Infection. 2004;6(15):1382-1387.. O papel dos TLRs na cicatrização cutânea vem sendo fortemente explorado nos estudos científicos sobretudo no tocante à fibrose cicatricial1212 Lai Y, Di Nardo A, Nakatsuji T, Leichtle A, Yang Y, Cogen A et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nature Medicine. 2009;15(12):1377-1382.,1313 Lai Y, Gallo R. Toll-Like Receptors in Skin Infections and Inflammatory Diseases. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008;8(3):144-155.,1515 Lin Q, Wang L, Lin Y, Liu X, Ren X, Wen S et al. Toll-Like Receptor 3 Ligand Polyinosinic:Polycytidylic Acid Promotes Wound Healing in Human and Murine Skin. Journal of Investigative Dermatology. 2012;132(8):2085-2092.,1818 Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Microbes and Infection. 2004;6(15):1382-1387.,1919 Poutahidis T, Kearney S, Levkovich T, Qi P, Varian B, Lakritz J et al. Microbial Symbionts Accelerate Wound Healing via the Neuropeptide Hormone Oxytocin. PLoS ONE. 2013;8(10):e78898.,2222 Sato T, Yamamoto M, Shimosato T, Klinman D. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair and Regeneration. 2010;18(6):586-593.. Conforme resultados encontrados nos marcadores histológicos aqui avaliados, acredita-se que eles podem estar relacionados com a ação dos probióticos, via TLRs, na cicatrização cutânea em ratos.

Os achados ainda foram confirmados pela análise da deposição do colágeno. O colágeno tipo III é rico em água, pouco polimerizado e tem função de preenchimento. O tipo I é pobre em água e muito polarizado, cuja função é de tração. A resistência de uma cicatriz é dada pela quantidade de colágeno depositada e pela forma com que as fibras estão depositadas1010 Houdek M, Wyles C, Stalboerger P, Terzic A, Behfar A, Moran S. Collagen and Fractionated Platelet-Rich Plasma Scaffold for Dermal Regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 2016;137(5):1498-1506.,2222 Sato T, Yamamoto M, Shimosato T, Klinman D. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair and Regeneration. 2010;18(6):586-593.. No início do processo a cicatrização começa da periferia para o centro, impulsionando a organização das fibras para remodelar o colágeno. O preenchimento dado pelo colágeno tipo III à área da cicatriz foi maior e ocorreu no 7PO no grupo probiótico, mas não no grupo controle, resultando em maior produção de colágeno tipo I, que foi maior no grupo probiótico no 10PO.

Poutahidis et al.1919 Poutahidis T, Kearney S, Levkovich T, Qi P, Varian B, Lakritz J et al. Microbial Symbionts Accelerate Wound Healing via the Neuropeptide Hormone Oxytocin. PLoS ONE. 2013;8(10):e78898., avaliaram o uso oral de bebida probiótica (L. reuteri) em camundongos, onde o fechamento da ferida marcado pela maturação acelerada do tecido de granulação e a deposição de colágeno, ocorreu a partir do sexto dia de pós-operatório no grupo suplementado com L. reuteri, quando comparados com o controle suplementados com água, semelhante aos nossos achados.

Modular a microbiota utilizando probióticos de diferentes espécies envolve diferentes mecanismos incluindo: a) competição com bactérias patogênicas por nutrientes e sítios de ligação na célula hospedeira; b) inativação de toxinas e metabólitos; c) produção de substâncias antimicrobianas que inibem o crescimento de microrganismos patológicos; d) estimulação/modulação da resposta imune do hospedeiro, envolvendo células epiteliais, células dendríticas e linfócitos T reguladores, tanto no trato gastrointestinal como na pele66 Chen L, Guo S, Ranzer M, DiPietro L. Toll-Like Receptor 4 Has an Essential Role in Early Skin Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 2013;133(1):258-267.,1919 Poutahidis T, Kearney S, Levkovich T, Qi P, Varian B, Lakritz J et al. Microbial Symbionts Accelerate Wound Healing via the Neuropeptide Hormone Oxytocin. PLoS ONE. 2013;8(10):e78898..

Estudos avançados feitos com modelos animais e com humanos mostrou os efeitos benéficos entre as bactérias do intestino e a aparência da pele. Um deles realizado por Levkovich et al.2424 Tagliari E, Campos A, Costa-Casagrande T, Salvalaggio P. The Impact of the Use of Symbiotics in the Progression of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in a Rat Model. ABCD Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo). 2017;30(3):211-215. trouxeram resultados positivos com a suplementação de Lactobacillus reuteri no aumento da espessura dérmica e da foliculogênese, além de potencializar a produção de sebo e melhorar o brilho da pele2525 Vizzotto Junior A, Noronha L, Scheffel D, Campos A. Influência da cisplatina administrada no pré e no pós-operatório sobre a cicatrização de anastomoses colônicas em ratos. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. 2003;39(2):143-149..

Heydari et al.99 Heydari Nasrabadi. Study of cutaneous wound healing in rats treated with Lactobacillus plantarum on days 1, 3, 7, 14 and 21. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2011;5(21). estudaram o efeito de probiótico (L. plantarum) em feridas cutâneas de ratos nos dias 1, 3, 7, 14 e 21 do pós-operatório, onde os resultados encontrados foram fase aguda mais precoce com menor número total de neutrófilos no 3PO e redução da área da ferida; portanto, esta redução pode acelerar o processo de cicatrização, reduzir a inflamação, e fatores de crescimento liberados ajudaram a ter re-epitelização mais precoce. Estes achados corroboram com os aqui apresentados.

Probióticos ainda participam na melhora do processo de diferenciação e queratinização da pele, na modulação da resposta imune cutânea e no processo de cicatrização cutânea1919 Poutahidis T, Kearney S, Levkovich T, Qi P, Varian B, Lakritz J et al. Microbial Symbionts Accelerate Wound Healing via the Neuropeptide Hormone Oxytocin. PLoS ONE. 2013;8(10):e78898.. Probióticos administrados oralmente resultam em aumento de células Treg Foxp3+ nos linfonodos da pele, regulando positivamente a expressão de IL10, diminuindo o dano tecidual na borda da ferida e reduzindo a inflamação em modelo murino11 Belkaid Y, Tamoutounour S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nature Reviews Immunology. 2016;16(6):353-366..

CONCLUSÃO

O uso perioperatório de probiótico administrado por via oral foi associado com redução mais rápida da área da ferida em ratos, provavelmente pela redução da fase inflamatória, acelerando o processo de fibrose e a deposição de colágeno.

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  • Fonte de financiamento: Este estudo foi financiado em parte pelo FQM-FARMA, e em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES) - Código Financiamento 001

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    09 Dez 2019
  • Data do Fascículo
    2019

Histórico

  • Recebido
    10 Jun 2019
  • Aceito
    22 Jul 2019
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