Caracterização de um modelo experimental de neuropatia em ratos diabéticos induzidos pela aloxana

Characterization of an experimental model of neuropathy in alloxan-induced diabetic rats

Resumos

Cem ratos norvégicus, machos, com aproximadamente 3 meses de idade foram distribuídos por sorteio em 2 grupos experimentais: Grupo Controle (GC): com 50 ratos sadios, não diabéticos e Grupo Diabético (GD): com 50 ratos diabéticos, induzidos pela aloxana, sem qualquer tratamento. Cada grupo foi dividido em 5 subgrupos com 10 ratos cada e sacrificados com 1, 3, 6, 9 e 12 meses de seguimento, respectivamente. Parâmetros clínicos (peso, ingestão hídrica e alimentar, e diurese) e laboratoriais (glicemia, glicose urinária e insulina) foram documentados em todos os momentos de avaliação. Um segmento do nervo ciático foi obtido de cada animal, em ambos os grupos, para estudo à MO. e ME. Alterações clínicas e laboratoriais significativas (P<0,01), compatíveis com diabetes grave, foram observadas em todos os animais do GD a partir do 4o dia após a indução. Ratos de ambos os grupos apresentaram alterações no número de fibras mielínicas e nos depósitos intraaxonais de glicogênio que não diferiram, estatisticamente, aos 1, 3 e 6 meses de seguimento. Entretanto, aos 9 e 12 meses, ratos do GD apresentaram diminuição significativa no número de fibras mielínicas, com aumento do número de fibras mielínicas de menor calibre, quando comparados com ratos do GC (P<0,05). Grânulos de glicogênio intraaxonais também foram mais acentuados em ratos do GD no 9o e 12o mês de seguimento. Não foram observadas diferenças na densidade de fibras amielínicas ou alterações ultraestruturais significativas entre os dois grupos, em relação aos espaços intraaxonais e endoneurais, bainhas de mielina e células de Schwann durante todo o estudo.

Diabetes Mellitus; Aloxana; Nervo ciático


One-hundred male norvegicus rats, approximately 3-months old, were randomly assigned to two experimental groups: Control Group (CG) included 50 non-diabetic control rats and Diabetic Group (DG) included 50 alloxan untreated-diabetic rats. Each group was further divided into 5 subgroups of 10 rats and sacrificed at 1, 3, 6, 9, and 12 months of follow-up, respectively. Clinical (body weight, water and food intake and urine output) and laboratory parameters (blood glucose, urinary glucose and insulin) were documented in all moments of evaluation. A segment of the sciatic nerve was taken from each animal in both groups for light and eletron microscopy. Significant clinical and laboratory changes (P<0.01), compatibles with severe diabetes, were observed in all animals of DG beginning at 4 th day after diabetes induction. There were no significant changes in the number of myelinic fibers and of glycogen granules in DG rats when compared with CG rats at 1, 3, and 6 months of follow-up. However, DG rats presented a significantly decreased number of myelinic fibers, with increase of the number of smaller myelinic fibers, when compared with CG rats (P < 0.05) at 9 and 12 months of follow-up. Intra-axonal glycogen granules were also more evident in DG rats in these periods. No difference was observed between the two experimental groups in the number of unmyelinated fibers. There was also no structural difference in both groups in the intra-axonal and endoneural spaces, in the myelin sheath or in the Schwann cells all over the study.

Diabetes Mellitus; Alloxan; Sciatic nerve


CARACTERIZAÇÃO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE NEUROPATIA EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS PELA ALOXANA1 1. Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP). 2. Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP. 3. Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio. 4. Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília. 5. Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP. 6. Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

José Lúcio Martins Machado2 1. Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP). 2. Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP. 3. Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio. 4. Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília. 5. Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP. 6. Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

Arthur Roquete de Macedo3 1. Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP). 2. Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP. 3. Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio. 4. Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília. 5. Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP. 6. Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

Maria Dorvalina da Silva4 1. Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP). 2. Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP. 3. Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio. 4. Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília. 5. Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP. 6. Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

César Tadeu Spadella5 1. Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP). 2. Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP. 3. Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio. 4. Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília. 5. Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP. 6. Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

Mário Rubens Guimarães Montenegro6 1. Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP). 2. Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP. 3. Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio. 4. Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília. 5. Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP. 6. Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

Machado JLM, Macedo AR, Silva MD, Spadella CT, Montenegro MRG. Caracterização de um modelo experimental de neuropatia em ratos diabéticos induzidos pela aloxana. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Apr-Jun;15(2). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb

RESUMO: Cem ratos norvégicus, machos, com aproximadamente 3 meses de idade foram distribuídos por sorteio em 2 grupos experimentais: Grupo Controle (GC): com 50 ratos sadios, não diabéticos e Grupo Diabético (GD): com 50 ratos diabéticos, induzidos pela aloxana, sem qualquer tratamento. Cada grupo foi dividido em 5 subgrupos com 10 ratos cada e sacrificados com 1, 3, 6, 9 e 12 meses de seguimento, respectivamente. Parâmetros clínicos (peso, ingestão hídrica e alimentar, e diurese) e laboratoriais (glicemia, glicose urinária e insulina) foram documentados em todos os momentos de avaliação. Um segmento do nervo ciático foi obtido de cada animal, em ambos os grupos, para estudo à MO. e ME. Alterações clínicas e laboratoriais significativas (P<0,01), compatíveis com diabetes grave, foram observadas em todos os animais do GD a partir do 4o dia após a indução. Ratos de ambos os grupos apresentaram alterações no número de fibras mielínicas e nos depósitos intraaxonais de glicogênio que não diferiram, estatisticamente, aos 1, 3 e 6 meses de seguimento. Entretanto, aos 9 e 12 meses, ratos do GD apresentaram diminuição significativa no número de fibras mielínicas, com aumento do número de fibras mielínicas de menor calibre, quando comparados com ratos do GC (P<0,05). Grânulos de glicogênio intraaxonais também foram mais acentuados em ratos do GD no 9o e 12o mês de seguimento. Não foram observadas diferenças na densidade de fibras amielínicas ou alterações ultraestruturais significativas entre os dois grupos, em relação aos espaços intraaxonais e endoneurais, bainhas de mielina e células de Schwann durante todo o estudo.

DESCRITORES: Diabetes Mellitus. Aloxana. Nervo ciático.

INTRODUÇÃO

A neuropatia periférica é uma das complicações observadas com freqüência entre pacientes diabéticos6,12,19. A sua gênese e evolução, no entanto, precisam ser bem caracterizadas, para que a eficácia dos diversos esquemas terapêuticos propostos para o seu controle seja testada.

Nesse particular, a reprodução das alterações provocadas pelo diabetes no ser humano, em animais de experimentação, parece ser o caminho mais apropriado para obtermos respostas mais concretas para estas indagações, por propiciar estudos randomizados de longo seguimento, comUniformidade da amostra e controle mais fidedigno das variáveis.

No presente trabalho apresentamos um estudo experimental realizado no rato portador de diabetes, induzido quimicamente pela administração endovenosa de aloxana, com ênfase aos aspectos clínicos e laboratoriais da doença e, principalmente, às alterações morfológicas e morfométricas observadas no nervo ciático13.

Esperamos que os nossos resultados e conclusões possam contribuir para a melhor compreensão dos fenômenos biológicos que acompanham o diabetes e suas complicações à longo prazo.

MÉTODO

Animais e grupos

Cem ratos norvégicus adultos, machos, com aproximadamente 3 meses de idade foram distribuídos por sorteio em 2 grupos experimentais: Grupo Controle (GC) constituído de 50 animais sadios, não diabéticos e Grupo Diabético (GD) constituído de 50 animais diabéticos, sem qualquer tipo de tratamento. Cada grupo foi posteriormente dividido em 5 subgrupos com 10 animais cada e sacrificados com 1, 3, 6, 9 e 12 meses de seguimento. Animais diabéticos que evoluíram para o óbito durante o seguimento foram repostos nos respectivos subgrupos.

O diabetes foi induzido pela administração endovenosa de aloxana (Sigma Chemical Co., USA) diluída em solução aquosa à 2%, na dose única de 42mg/kg de peso corporal. Somente ratos apresentando glicose sangüínea acima de 200mg/dL, glicose urinária acima de 3.000 mg/dL e com sinais clínicos de diabetes grave, representados por polidpsia, poliúria e polifagia, após duas determinações sucessivas, foram incluídos no experimento.

Avaliação clínica e laboratorial

Sete dias antes e 14 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses após a indução do diabetes com aloxana ou de seguimento (GC), ratos de ambos os grupos experimentais foram colocados em gaiolas metabólicas durante um período de 24 h, sendo registrados o peso corporal em gramas, a ingestão hídrica (ml/24 h), a ingestão alimentar (g/12 h), a diurese (ml/24 h) e colhido sangue e urina, respectivamente, para as dosagens da glicemia (mg/dL) e insulina (mU/ml) e da glicose urinária (mg/dL). A glicose sangüínea e urinária foram dosadas por método enzimático (Celm Lab. Modernos, São Paulo) e a insulina por radioimunoensaio em fase sólida (Coat – A – Count Insulin, DPC, Los Angeles, USA).

Preparo do material para o exame anatomopatológico

Após registrados os parâmetros clínicos e laboratoriais, os animais de ambos os grupos experimentais foram sacrificados, com retirada de segmentos do nervo ciático de 5 ratos, em cada subgrupo (normal e diabético) com 1, 3, 6, 9, e 12 meses de seguimento.

Os segmentos do nervo ciático foram imersos em glutaraldeído a 1%, em tampão fosfato, seccionados em 3 ou 4 porções no sentido transversal e deixados em solução, para a primeira fixação, por um período de 3 horas. A seguir, esse material foi processado para microscopia óptica (MO.) e eletrônica (ME.) segundo padronização, respectivamente, dos Laboratórios de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP e de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências do Campus de Botucatu – UNESP.

Avaliação morfológica e morfométrica

À M.O. foi feita a contagem das fibras mielínicas e a medida das áreas dos axônios, das fibras e das bainhas de mielina. À M.E. foram estudadas a densidade de fibras amielínicas e de grânulos de glicogênio intraaxonais, e a presença de alterações ao nível das células de Schwann, vasos endoneurais e organelas dos espaços intraaxonais e endoneurais.

Para a determinação do número de fibras mielínicas foram obtidas lâminas com secções em corte fino do nervo ciático, no sentido transversal dos fascículos nervosos. Com o auxílio de um microscópio óptico com gratícula integradora de 400 pontos e aumento de 16x (Carl Zeiss do Brasil Ltda.), foram contadas todas as fibras mielínicas contidas dentro de cada quadrado sobreposto ao fascículo nervoso; tendo-se o cuidado de não haver sobreposição das áreas estudadas. Para essa contagem, em cada subgrupo, 2 blocos de cada animal, 2 fascículos nervosos por cada bloco e 5 campos por cada fascículo nervoso foram estudados ao acaso. A leitura foi processada por dois examinadores diferentes, sem o conhecimento prévio do grupo (duplo-cego), com uma margem de erro inferior a 5%.

Para o estudo da área dos axônios, das fibras e das bainhas de mielina, foram obtidas fotografias representativas das várias porções dos fascículos nervosos, com o auxílio de um fotomicroscópio com objetiva de imersão, com aumento final de 1440 vezes.

Os campos estudados foram fotografados por um único pesquisador com filme Panatomic X, 32 ASA (Kodak Company Eastman Co., USA). As medidas morfométricas para o cálculo da área da fibra nervosa e do axônio foram baseadas no método descrito por Behse (1990)2, tendo sido utilizado um processador computadorizado (Mini-Mop-Bildanalyse-Kontron Eletronic Group) com cursor circular sobre prancha digitadora.

Para a contagem das fibras amielínicas e dos grânulos de glicogênio intraaxonais foi utilizado um microscópio eletrônico de transmissão Philips EM 301 (Philips SA). Dois fascículos nervosos de cada bloco (2 bloco/ animal/subgrupo) foram selecionados ao acaso e 5 campos/ fascículo nervoso foram fotografados, com micrografias com aumento final de 5000 X, utilizando um filme Ektacrome Kodak e papel fotográfico Kodacrome RC Print F3 Kodak. A contagem foi feita manual e checada por um segundo pesquisador, sem o conhecimento prévio do grupo.

Análise estatística

Os dados clínicos e laboratoriais foram analisados pela análise multidimensional dos perfis médios, conforme Morrison (1976)15 com nível de significância para P<0,01. Os dados histológicos e morfométricos foram estudados pela Análise de Variância e Teste "t" de Student com nível de significância para P<0,05%. Para o cálculo da relação entre a área do axônio e a área da bainha de mielina foi utilizado o escore Z.

RESULTADOS

Clínica e laboratório

Todos os animais do GC evoluíram em bom estado geral, com ganho progressivo de peso corporal, sem qualquer anormalidade clínica ou laboratorial durante todo o seguimento. Em contraste, ratos do GD evoluíram com perda progressiva do peso e aumento estatisticamente significativo da ingestão hídrica, ingestão alimentar, diurese, glicose sangüínea e urinária quando comparados com ratos do GC (P<0,01). Os níveis de insulina plasmática foram significativamente diminuídos em ratos diabéticos quando comparados com ratos normais controles.

Não ocorreram óbitos no GC durante todo o seguimento. Por outro lado, um número significativo de animais precisaram ser repostos no GD em razão de mortalidade determinada pela ação tóxica da aloxana no período pós-indução ou em decorrência de complicações, principalmente, de ordem infecciosa associadas à desnutrição, no período de seguimento tardio.

Da amostra inicial de ratos utilizados para compor o GD, 38,8% dos animais morreram até o 14o dia de pós-indução (99 ratos), 20% foram desprezados por não terem ficado diabéticos ou apresentarem a doença de forma leve ou moderada (51 ratos) e 41,2% tornaram-se diabéticos graves (105 ratos), sendo utilizados no experimento. Desses, 52,4% (55 ratos) ainda morreram no seguimento de 12 meses, em decorrência de pneumonia, distúrbio metabólico e/ou desnutrição.

A tabela 1 ilustra os parâmetros clínicos e laboratoriais observados em ratos normais e diabéticos ao longo dos 12 meses de seguimento.

Morfologia e morfometria

Todos os achados morfológicos e morfométricos do nervo ciático de ratos normais (GC) e diabéticos (GD) não diferiram estatisticamente (P>0,05) nas avaliações efetuadas com 1, 3 e 6 meses de seguimento. Todavia, aos 9 e 12 meses de seguimento, ratos diabéticos apresentaram alterações degenerativas do nervo ciático numa velocidade mais acelerada que a observada em ratos normais.

Aos 9 e 12 meses ratos do GD apresentaram diminuição significativa na contagem do número de fibras mielínicas (fibras/mm2) quando comparada com o GC (P<0,05). Naquele grupo houve ainda um aumento significativo no número de fibras mielínicas de menor calibre (classe 1) quando comparado com ratos do grupo controle (GC) (Fig. 1). Relativamente, o número de fibras mielínicas de maior calibre (classes 2 e 4) foi mais acentuado em ratos do GC. Em nosso estudo, contudo, não houve diferenças significativas entre os dois grupos, quando avaliada a densidade de fibras amielínicas.

Também não observamos diferenças estatisticamente significativas (P>0,05) entre os dois grupos experimentais para as áreas das fibras mielínicas e dos axônios, em qualquer momento de seguimento. Porém, quando calculada a relação entre a área do axônio e a área da bainha de mielina, utilizando o escore Z, observamos que animais diabéticos, independentemente do tamanho da fibra nervosa, apresentaram uma freqüência de áreas axonais proporcionalmente menores em relação às áreas da bainha de mielina (Fig. 2).

A quantidade de grânulos de glicogênio intraaxonais foi significativamente maior em animais diabéticos (P < 0,01) quando comparada com ratos normais aos 9 e 12 meses (Fig. 3).

Apesar das alterações citadas, do ponto de vista ultraestrutural, não foram observadas diferenças significativas entre os dois grupos em relação ao aspecto dos vasos endoneurais, das células de Schwann e dos axônios; não sendo observadas, portanto, alterações degenerativas das organelas intracitoplasmáticas, depósitos de corpúsculos lipídicos, inclusões citoplasmáticas anômalas, proliferação endotelial ou espessamento da membrana basal dos capilares endoneurais, durante todos os momentos de avaliação.

DISCUSSÃO

Apesar da aloxana determinar em ratos alterações clínicas e laboratoriais que muito se assemelham às alterações observadas no diabetes humano, nem todas as lesões observadas no sistema nervoso periférico de pacientes diabéticos podem ser integralmente reproduzidas no laboratório.

Felizmente, porém, a maioria das lesões nervosas fundamentais do diabetes, necessárias à compreensão fisiopatológica da maioria dos distúrbios funcionais dos nervos periféricos do homem, pode ser obtida com o uso da aloxana18 ou da estreptozotocina22.

A aloxana, uma derivada do ácido úrico, é capaz de produzir diabetes permanente em animais, graças ao seu efeito tóxico seletivo sobre as células beta pancreáticas, causando uma insuficiência insulínica primária do pâncreas7. Tal propriedade lhe confere vantagens sobre outros métodos diabetogênicos, além do seu baixo custo, facilidade na indução do diabetes e uso padronizado no meio científico por diversos serviços, incluindo o nosso laboratório17,28.

Todavia, diferentemente das alterações metabólicas produzidas pela aloxana, as alterações observadas no nervo ciático e em outros nervos do hospedeiro diabético ainda são bastante discutíveis. Os protocolos de estudos são múltiplos e os resultados ainda muito variáveis ou mesmo conflitantes, em razão de toda uma gama de fatores a serem padronizados em estudos dessa natureza, que vão desde a escolha do método mais apropriado para as medidas do comprimento, número e área das estruturas nervosas, até fatores relativos à idade do animal, peso, estado nutricional, tempo de seguimento e preparo do material para o estudo anatomopatológico. Por estas razões, procuramos eliminar todos os fatores de erros em nosso material, com pareamento completo da amostra e uso de metodologia avançada de análise, sempre checada por dois pesquisadores diferentes, sem o conhecimento prévio do grupo a que o animal pertencia.

Em nosso estudo observamos que tanto animais diabéticos como animais normais apresentam alterações morfológicas e ultraestruturais no nervo ciático que não diferiram estatisticamente até o 6o mês de seguimento. Isto significa que nem todas as alterações nervosas observadas no rato diabético até esse período, podem ser imputadas ao próprio diabetes.

Tal fato pode facilmente levar a erros na interpretação de resultados, visto que lesões classificadas como patológicas até esta fase podem, na verdade, serem conseqüência apenas do processo normal de envelhecimento.

Desta forma, nossos resultados confirmam estudos anteriores18,20 de que a lesão dos nervos periféricos em animais diabéticos é mais evidente numa fase tardia da doença; em nossos estudos, muito provavelmente, com início entre o 6o e o 9o mês de diabetes. Estas observações, no entanto, diferem dos relatos de alguns autores10,23 os quais descreveramm alterações nos nervos periféricos de ratos diabéticos precocemente, já a partir do 2o mês de indução. Acreditamos, porém, ser um tempo de diabetes por demais reduzido para observarmos modificações distintas das verificadas em animais normais.

No presente trabalho observamos que animais diabéticos, quando comparados com os seus controles, nas avaliações realizadas no 9o e 12o mês de diabetes, apresentamUma diminuição significativa no número de fibras mielínicas, com um aumento marcante no número de fibras nervosas de pequeno calibre. Estas alterações são acompanhadas de um aumento significativo do número de depósitos intraaxonais de glicogênio, sugerindo que os processos de degeneração, atrofia e desmielinização da fibra nervosa e dos axônios são mais acelerados no animal diabético do que no animal normal, a partir do 9o mês da indução do diabetes.

A diminuição do número de fibras mielínicas em animais diabéticos têm sido apontada por vários autores4,23,25. No entanto, esses dados precisam ser analisados com critério em função dos inúmeros fatores de erro já apontados nesta discussão. Alguns autores relatam, por exemplo, uma diminuição progressiva do número e tamanho das fibras nervosas motoras de ratos, principalmente das fibras maiores, com o transcorrer da idade11. Daí a necessidade do pareamento da amostra em função da idade, sexo e peso do animal, para não incorrermos em interpretações enganosas.

A redução do número de fibras mielinizadas podem, porém, explicar algumas das alterações funcionais dos nervos periféricos de animais e homens diabéticos, em particular, a redução da velocidade de condução nervosa8,25. Essa correlação, no entanto, é discutível32.

Um retardo no crescimento da fibra nervosa, traduzida por uma freqüência aumentada de fibras nervosas de calibres menores, em relação às fibras maiores, também foi verificada nos nossos animais diabéticos. Esta alteração, provavelmente secundária muito mais a uma diminuição da síntese da mielina pelas células de Schwann, do que propriamente por um aumento do catabolismo ou destruição da mielina3, parece anteceder os desarranjos intraaxonais observados no rato diabético.

Todavia, esta alteração também precisa ser criteriosamente analisada porque são diversos os fatores que influenciam nas dimensões da fibra nervosa e de seus componentes estruturais. O tamanho da fibra aumenta com a idade do animal, comUm crescimento contínuo até 9 meses25. A indução do diabetes causa retardo no crescimento do esqueleto, o que ocasiona fibras proporcionalmente também menores22. O estado nutricional e a diminuição da ingestão alimentar também afetam o tamanho e a espessura das fibras nervosas27. O estado de hidratação do animal pode contribuir para o processo de retração da fibra nervosa10. O processo de fixação e o preparo do material para o estudo anatomopatológico também podem afetar o tecido nervoso levando, principalmente, ao edema e alongamento da fibra nervosa9. À luz de toda essa multiplicidade de variáveis, nunca será demais salientarmos a necessidade de um absoluto controle do experimento.

Uma alteração na relação entre a área do axônio e a área da bainha de mielina, com áreas axonais proporcionalmente menores em animais diabéticos, também foi observada no nosso material. Este achado, reforça a possibilidade de uma atrofia axonal determinada pelo diabetes, a qual explica a freqüência de ratos diabéticos com bainhas de mielina relativamente mais "espessas" do que a observada em ratos normais.

As causas que levariam às alterações do diâmetro do axônio e sua relação com o espessamento da bainha de mielina não são totalmente esclarecidas. JAKOBSEN & LUNDBAEK (1976)8 estudando ratos diabéticos induzidos pela estreptozotocina demonstraram uma diminuição do diâmetro axonal mais acentuado que o diâmetro total da fibra nervosa. Tal fato sugere uma atrofia axonal causada pelo diabetes, que pode ser agravada pela malnutrição usualmente presente nestes animais4.

Essa atrofia axonal observada em ratos diabéticos poderia, segundo alguns autores, ser conseqüência, também, da diminuição no transporte de proteínas para o interior do axônio26 ou mesmo relacionada à desidratação do próprio axônio, causada pela hiperosmolaridade tecidual vigente no estado diabético29.

Estas conclusões, no entanto, são discutíveis visto que alguns estudos têm relatado tanto aumento como diminuição do diâmetro axonal, em função do segmento nervoso analisado; parecendo haver um aumento do tamanho axonal nas porções mais distais dos nervos e, contrariamente, uma diminuição nas porções mais próximais, em função, respectivamente, da menor ou maior espessura da bainha de mielina5,14. Isto vem demonstrar que as alterações nervosas observadas em ratos diabéticos podem se expressar de diferentes formas emUm mesmo nervo, sendo o comprometimento mais acentuado na porção mais distal.

A contagem de grânulos de glicogênio intraaxonais também foi significativamente maior em animais diabéticos do que em animais controles com 9 e 12 meses de seguimento. Esses grânulos, descritos por vários autores16,18,20 e formados por corpúsculos eletro-densos, limitados por uma fina membrana, apresentam-se como verdadeiros estoques do glicogênio no interior dos axônios. Ocorrem quase que exclusivamente em ratos, mas já foram descritos em humanos31 e em camundongos diabéticos por mutação gênica24, não sendo um fenômeno típico do tecido nervoso, pois têm sido encontrados no tecido renal20 e retina21.

Esses grânulos, descritos em situações que envolvem hipóxia tecidual no miocárdio canino1, encontram-se aumentados nos nervos periféricos em decorrência da autonomia do tecido nervoso, em relação à insulina. Os tecidos que dependem da insulina para seu suprimento de glicose tornam-se depletados em seus estoques de glicogênio, enquanto que os tecidos insensíveis à insulina passam a conter taxas elevadas de glicogênio. Isto explica porque a quantidade de glicogênio mostra-se aumentada no tecido nervoso de ratos diabéticos aloxânicos e extremamente diminuída no fígado e tecido muscular desses animais. Em contraste, porém, alguns autores relacionam o aparecimento de grânulos de glicogênio apenas ao processo normal de envelhecimento30.

Apesar de alguns relatos mostrarem perdas tanto de fibras mielínicas como de fibras amielínicas em animais diabéticos, a contagem de fibras amielínicas não mostrou diferenças significativas entre animais diabéticos e normais em nosso trabalho. Tal achado reforça as observações da maioria dos autores de que as principais alterações verificadas nos nervos periféricos de animais diabéticos comprometem, principalmente, as fibras mielinizadas8,16,18,25.

Finalmente, nenhuma diferença significativa foi detectada nas características ultraestruturais de nervos de animais diabéticos e de animais normais, em relação à estrutura interna dos axônios e organelas ou em relação à presença de inclusões citoplasmáticas anômalas, proliferação endotelial e/ou espessamento da membrana basal dos capilares da "vasa nervorum".

Estes achados diferiram dos relatos encontrados nos vasos endoneurais de pacientes diabéticos de longa duração, onde o espessamento da membrana basal, principalmente, é de fácil identificação6,19.

CONCLUSÕES

A aloxana administrada no rato por via endovenosa determina alterações clínicas e laboratoriais bem definidas, compatíveis com diabetes grave. Essas alterações levam a um processo degenerativo do nervo ciático, significativamente mais acelerado no rato diabético em relação ao rato normal, que se inicia entre o 6o e o 9o mês após a indução da doença.

As alterações observadas caracterizaram de forma bem documentada um modelo experimental de neuropatia diabética que pode ser investigado frente aos diversos esquemas terapêuticos existentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Prof. Carlos Padovani pela análise estatística, às Sras. Maria Cecília Mercadante, Sônia Maria Capeletti e Irene Spago pela assistência técnica e laboratorial e à Profa. Elisa Aparecida Gregório pela assistência na microscopia eletrônica.

Machado JLM, Macedo AR, Silva MD, Spadella CT, Montenegro MRG. Characterization of an experimental model of neuropathy in alloxan-induced diabetic rats. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Apr-Jun;15(2). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb

SUMMARY: One-hundred male norvegicus rats, approximately 3-months old, were randomly assigned to two experimental groups: Control Group (CG) included 50 non-diabetic control rats and Diabetic Group (DG) included 50 alloxan untreated-diabetic rats. Each group was further divided into 5 subgroups of 10 rats and sacrificed at 1, 3, 6, 9, and 12 months of follow-up, respectively. Clinical (body weight, water and food intake and urine output) and laboratory parameters (blood glucose, urinary glucose and insulin) were documented in all moments of evaluation. A segment of the sciatic nerve was taken from each animal in both groups for light and eletron microscopy. Significant clinical and laboratory changes (P<0.01), compatibles with severe diabetes, were observed in all animals of DG beginning at 4 th day after diabetes induction. There were no significant changes in the number of myelinic fibers and of glycogen granules in DG rats when compared with CG rats at 1, 3, and 6 months of follow-up. However, DG rats presented a significantly decreased number of myelinic fibers, with increase of the number of smaller myelinic fibers, when compared with CG rats (P < 0.05) at 9 and 12 months of follow-up. Intra-axonal glycogen granules were also more evident in DG rats in these periods. No difference was observed between the two experimental groups in the number of unmyelinated fibers. There was also no structural difference in both groups in the intra-axonal and endoneural spaces, in the myelin sheath or in the Schwann cells all over the study.

SUBJECT HEADINGS: Diabetes Mellitus. Alloxan. Sciatic nerve.

Endereço para correspondência:

José Lúcio Martins Machado

Departamento de Cirurgia e Ortopedia

Disciplina de Cirurgia Pediátrica

Faculdade de Medicina de Botucatu – Campus UNESP

Botucatu - SP

Data do recebimento: 15/09/1999

Data da revisão: 29/10/1999

Data da aprovação: 14/11/1999

  • 1. Baja LM, Ferrans VJ, Levitskey S. Occurrence of intramitochondrial glycogen in canine myocardium after prolonged anoxic cardiac arrest. J Mol Cell Cardiol 1972;4:237-54.
  • 2. Behse F. Morphometric studies on the human sural nerve. Acta Neurol Scand 1990;132(suppl.):3-38.
  • 3. Bestetti G, Rossi GL, Zemp C. Changes in peripheral nerves of rats four months after induction of streptozotocin diabetes. A quantitative and qualitative study. Acta Neuropathol 1981;54:129-34.
  • 4. Brown AK, Sumer AJ, Greene DA. Distal neuropathy in experimental diabetes mellitus. Ann Neurol 1980;8:168-78.
  • 5. Chokroverty S, Reyes MG, Seiden D. Axonal neuropathy in acute streptozotocin diabetes. Ann Neurol 1980;8:104.
  • 6. Dick PJ, Karnes J, OBrien PC. Diagnosis, staging, and classification of diabetic neuropathy and associations with other complications: In: Dyck PJ, Thomas PK, Asbury AK. Diabetic neuropathy. Philadelphia: W. B. Saunders; 1987. p 36-44.
  • 7. Dunn JS, Sheehan HL, McLectchie NGB. Necrosis of islets of Langerhans produced experimentally. Lancet 1943;1:484-7.
  • 8. Jakobsen J, Lundbaeck K. Neuropathy in experimental diabetes: an animal model. Br Med J 1976;2:178-279.
  • 9. Jakobsen J. Axonal dwindling in early experimental diabetes. I. A study of cross sectioned nerves. Diabetologia 1976;12:539-46.
  • 10. Jakobsen J. Peripheral nerves in early experimental diabetes: expansion of the endoneural space as a cause of increased water content. Diabetologia 1978;14:113-9.
  • 11. Knox CA, Kokmen E, Dyck DJ. Morphometric alteration of rat myelinated fibers with aging. J Neuropathol Exp Neurol 1989;2:119-39.
  • 12. Królewski AS, Warram JH. Epidemiology of diabetes mellitus. In: Marble A, Krall LP, Bradley RF, Christlieb AR, Soeldner JS. Joslins diabetes mellitus. 3ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1985. p 12-42.
  • 13. Machado JLM. Neuropatia diabética experimental: estudo morfológico e morfométrico do nervo ciático de ratos diabéticos (Tese Mestrado). Botucatu: Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu; 1993.
  • 14. Medori R, Autilio-Gambetti L, Monaco S, Ganbetti P. Experimental diabetic neuropathy: impairement of slow transport with changes in axon cross sectional area. Proc. Nat Acad Sci 1985;82:7716-20.
  • 15. Morrison DF. Multivariate statistical methods. New York: Mc Graw Hill; 1967.
  • 16. Narama I, Kino I. Peripheral motor neuropathy in spontaneously diabetic WBN/Kob rats: a morphometric and eletron microscopic study. Acta Neuropathol 1989;79:52-60.
  • 17. Orloff MJ, Lee S, Charters AC, Grambort DE, Storck G, Knox D. Long-term studies of pancreas transplantation in experimental diabetes mellitus. Ann Surg 1975;182:198-206.
  • 18. Powell HC, Myers RR. Axonopathy and microangiopathy in chronic alloxan diabetes. Acta Neuropathol 1984;38:128-37.
  • 19. Powell HC, Rosoff J, Myers RR. Microangiopathy in human diabetic neuropathy. Acta Neuropathol 1985;68:295-305.
  • 20. Powell HC, Ward HW, Garrett RS. Glycogen accumulation in the nerves and kidneys of chronically diabetic rats. A quantitative eletron - microscopic study. J Neuropathol Exp Neurol 1979;38:114-27.
  • 21. Schellini SA. Retinopatia diabética experimental: estudo estrutural, ultraestrutural e morfométrico da retina de ratos normais, diabéticos e diabéticos tratados (Tese Doutorado). Botucatu: Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Medicina de Botucatu; 1992.
  • 22. Sharma AK, Bajada S, Thomas PK. Influence of streptozotocin-induced diabetes on myelinated nerve fiber maturation and on body growth in the rat. Acta Neuropathol 1981;53:257-65.
  • 23. Sharma AK, Thomas PC, Molina AF. Peripheral nerve fiber size in experimental diabetes. Diabetes 1977; 26: 639-92.
  • 24. Sharma AK, Thomas PK, Gabriel G, Stolinski C, Dockery P, Hollins GW. Peripheral nerve abnormalities in the diabetic mutant mouse. Diabetes 1983; 32: 1152-61.
  • 25. Sharma AK, Thomas PK. Peripheral nerve structure and function in experimental diabetes. J Neurol Sci 1974;23:1-15.
  • 26. Sidenius P, Jakobsen J. Impaired retrograde axonal transport from a nerve crush in streptozotocin diabetic rats. Diabetologia 1980;19:222-83.
  • 27. Sima AAF, Jankowska E. Sensory nerve conduction velocity as correlated to fiber size in experimental undernutrition in the rat. Neuropathol Appl Neurobiol 1975;1:31-7.
  • 28. Spadella CT, Bacchi CE, Mercadante MCS, Machado JLM, Schellini SA. Tratamento convencional com insulina versus lesőes renais no rato diabético aloxânico. Acta Cir Bras 1995;supl.2:103.
  • 29. Sugimura K, Windebank AJ, Natarajan V. Interstitial hyperosmolarity may cause axis cyllindres shrinkage in streptozotocin diabetic nerve. J Neuropathol Exp Neurol 1980;39:710-21.
  • 30. Thomas PK, King RHM, Sharma AK. Changes with age in the peripheral nerves of the rat. Acta Neuropathol 1980;52:1-6.
  • 31. Yasihashi S, Matsunaga M. Ultrastructural pathology of peripheral nerves in patients with diabetic neuropathy. J Exp Med 1979;129:357-66.
  • 32. Yasihashi S, Nishikira M, Baba M. Morphometrical analysis of the peripheral nerve lesions in experimental diabetes rats. J Exp Med 1979;129:139-99.

  • 1.
    Medicina de Botucatu – UNESP (FMB - UNESP).
    2.
    Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia Pediátrica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP.
    3.
    Prof. Titular da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB – UNESP e Diretor da Fundação Cesgranrio.
    4.
    Médica neurologista do Hospital Sarah Kubischek – DF Brasília.
    5.
    Prof. Ass. Doutor da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da FMB - UNESP.
    6.
    Prof. Emérito do Departamento de Patologia da FMB – UNESP.

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    08 Jun 2000
  • Data do Fascículo
    Jun 2000

Histórico

  • Aceito
    14 Nov 1999
  • Recebido
    15 Set 1999
  • Revisado
    29 Out 1999
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