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Boas práticas na criação e manutenção de zebrafish (Danio rerio) em laboratório no Brasil

Resumo

As Boas Práticas de Laboratório (BPL) são um sistema de controle de qualidade gerencial que abrange o processo organizacional e as condições sob as quais os estudos não clínicos de saúde e meio ambiente são desenvolvidos. Conforme a Organização Mundial da Saúde (OMS) as BPL devem conter cinco tópicos: recursos, caracterização, regras, resultados e controle de qualidade. O objetivo deste trabalho foi apresentar uma revisão conforme o padrão da OMS para a implementação das BPL em biotério de zebrafish. Considerando que a promoção da saúde única (animal, humana e ambiental) associada a um plano de educação, protocolos e registros são fundamentais para garantir a segurança e a integridade dos trabalhadores/pesquisadores, animais e meio ambiente assim como confiabilidade nos resultados gerados. De certa forma o Brasil ainda necessita de melhorias relacionadas ao bem-estar de organismos aquáticos (leis nacionais, acordos internacionais, programas corporativos e outros); especialmente em relação à utilização deste na pesquisa e desenvolvimento tecnológico. Desta forma, a implementação de BPL fornece uma orientação valiosa para a melhoria do bem-estar animal, e segurança do trabalhador vindo a facilitar a padronização da pesquisa.

Palavras-chave
Danio rerio ; padronização; bem-estar; diretrizes reguladoras; legislação

Abstract

Good Laboratory Practice (GLP) is a management quality control system that encompasses the organizational process and conditions under which non-clinical health and environmental studies are carried out. According to the World Health Organization, GLP must contain five topics: resources, characterization, rules, results, and quality control. This work aims to address a review according to WHO standards of implementing Good Laboratory Practices in zebrafish (Danio rerio) vivariums. Considering that the promotion of one health (animal, human, and environmental) associated with an education plan, protocols, and records are fundamental to guarantee the safety and integrity of employees, animals, and the environment as well as reliability in the results generated. In a way, Brazil still needs improvements related to the well-being of aquatic organisms (national laws, international agreements, corporate programs, and others), especially concerning its use in research and technological development. In this way, the implementation of GLPs provides valuable guidance for improving animal welfare and worker safety, facilitating the standardization of research.

Keywords
Danio rerio ; standardization; welfare; regulatory guidelines; legislation

Resumo gráfico

Boas práticas na criação e manutenção de zebrafish (Danio rerio) em laboratório no Brasil.

1. Introdução

A utilização de peixes como modelos de estudo biológico teve sua disseminação durante o século XIX. Uma das espécies precursoras foi o peixe-dourado, Carassius auratus, sobre a qual se realizaram estudos de toxicologia e fisiologia (11 Lapenta VA. Physiological assay of glucosides, toxins and poisons on gold fish, Carassius auratus. Proceedings of the Indiana Academy of Science. 1931;41:445-448.

2 Gersdorff WA. Relative toxicity of the cresols as demonstrated by tests with Carassius auratus. Journal of Agricultural Research. 1937;54(6):469-478.

3 Shlaifer A. Studies in mass physiology: effect of numbers upon the oxygen consumption and locomotor activity of Carassius auratus. Physiological Zoology. 1938;11(4):408-424. https://doi.org/10.1086/physzool.11.4.30152652.
https://doi.org/10.1086/physzool.11.4.30...
-44 Shaw RJ, Escobar RA, Baldwin FM. The influence of temperature and illumination on the locomotor activity of Carassius auratus. Ecology. 1938;19(2):343-346. https://doi.org/10.2307/1929654.
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). Atualmente, além de C. auratus, outras espécies também se destacaram como modelos para estudos científicos como Oryzias latipes, Rutilus rutilus, Gasterosteus aculeatus, Takifugu rubripes, Xiphophorus hellerii e Danio rerio. Essa última a mais estudada (55 Ribas L, Piferrer F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 2014;6(4):09-240. https://doi.org/10.1111/raq.12041.
https://doi.org/10.1111/raq.12041...
).

Embora o D. rerio (zebrafish) tenha sido proposto como uma espécie para uso em ciências pela primeira vez no ano de 1934 (66 Creaser WC. The Technic of Handling the Zebra Fish (Brachydanio rerio) for the Production of Eggs Which Are Favorable for Embryological Research and Are Available at Any Specified Time Throughout the Year. Copeia / JSTOR. 1934;1934(4):159-161. https://doi.org/10.2307/1435845.
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), o modelo começou a se popularizar após a publicação do trabalho da equipe de George Streisinger em 1981 onde são descritos métodos para geração de mutações por meio de gimnogênese (77 Streisinger G, Walker C, Dower N, Knauber D, Singer F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 1981;291(5813):293-296. https://doi.org/10.1038/291293a0.
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). No entanto, a grande consolidação de zebrafish como “modelo biomédico mundial” ocorreu a partir de 1996 quando foi publicado um volume no Journal of Development (Dezembro de 1996, Vol. 123) contendo 37 artigos sobre o screening genético de mais de 4.000 mutações. No Brasil, o primeiro trabalho publicado com zebrafish como modelo foi no ano de 1999 (88 Marí-Beffa M, Palmqvist P, Marín-Girón F, Montes GS, Becerra J. Morphometric study of the regeneration of individual rays in teleost tail fins. Journal of Anatomy. 1999;31(195):393-405. https://doi.org/10.1046/j.1469-7580.1999.19530393.x.
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). Além disso, o primeiro peixe transgênico desenvolvido no Brasil foi também uma linhagem de zebrafish (99 Figueiredo MA, Ceccon CF, Almeda DV, Marins LF. Improving the production of transgenic fish germlines: in vivo evaluation of mosaicism in zebrafish (Danio rerio) using a green fluorescent protein (GFP) and growth hormone cDNA transgene co-injection strategy. Genetics and Molecular Biology. 2007;30(1):31-36. https://doi.org/10.1590/S1415-47572007000100008.
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). Atualmente no país diversas instituições de pesquisa utilizam essa espécie como biomodelo, tendo como principais áreas de estudo: (1) Neurociência e Comportamento; (2) Farmacologia e Toxicologia e (3) Meio Ambiente e Ecologia (1010 Trigueiro NSS, Canedo A, Braga DLS, Luchiari AC, Rocha TL. Zebrafish as an Emerging Model System in the Global South: Two Decades of Research in Brazil. Zebrafish. 2020;17(6):412-425. https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1930.
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).

A utilização de vertebrados em pesquisas científicas no Brasil é regida pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) criado pela Lei nº 11.794/2008 e normatizado pelo decreto nº 6.899/2009 (1111 Brasil. Constituição da República Federativa do Brasil. Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008. Regulamenta o inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais; revoga a Lei no 6.638, de 8 de maio de 1979; e dá outras providências. Diário Oficial da União; 2008; nº 196; seção 1, p.1. Portuguese.-1212 Brasil. Presidência da República. Decreto nº 6.899, de 15 de julho de 2009. Dispõe sobre a composição do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - CONCEA, estabelece as normas para o seu funcionamento e de sua Secretaria-Executiva, cria o Cadastro das Instituições de Uso Científico de Animais - CIUCA, mediante a regulamentação da Lei n. 11.794, de 08.10.2008, que dispõe sobre procedimentos para o uso científico de animais, e dá outras providências. Diário Oficial da União; 2009; nº 134; seção 1; p.2. Portuguese.). Regularmente o CONCEA edita Resoluções Normativas (RNs), que têm força de lei no Brasil, que tratam sobre orientações e procedimentos para o uso científico de animais em instituições de ensino ou pesquisa científica. A RN nº 34/2017 do CONCEA (1313 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Resolução Normativa CONCEA nº 34, de 27 de julho de 2017. Institui o capítulo “Peixes mantidos em instalações de instituições de ensino ou pesquisa científica para fins de estudo biológico ou biomédico I - Lambari (Astyanax), Tilápia (Tilapia, Sarotherodon e Oreochromis) e Zebrafish (Danio rerio). Diário Oficial da União. 2017; seção 1, p. 218. Portuguese.), por exemplo, apresenta normativas diretamente relacionadas à criação e manutenção de zebrafish em atividades de ensino ou pesquisa científica. Diversas revisões e livros têm abordado os métodos para a criação de zebrafish em laboratório (1414 Brand M, Granato M, Nüsslein-Volhard C. Keeping and raising zebrafish. In: Dahm R and Nüsslein-Volhard C. Zebrafish: A Practical Approach. London: IRL Press; 2002. p. 7-37.

15 Matthews M, Trevarrow B, Matthews J. A virtual tour of the Guide for zebrafish users. Lab Animal. 2002;31(3):34-40.
-1616 Reed B, Jennings M. Guidance on housing and care of zebrafish Danio rerio. Horsham: Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA); 2011. 64p. (https://norecopa.no/no/textbase/guidance-on-the-housing-and-care-of-zebrafish-danio-rerio)
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). Recentemente Canedo et al. (1717 Canedo A, Saiki P, Santos AL, Carneiro SK, Souza, AM, Qualhato G, Brito RS, Mello-Andrade, Rocha, TL. O peixe-zebra (Danio rerio) encontra a bioética: os princípios éticos dos 10Rs na pesquisa. Ciência Animal Brasileira. 2022;23(1):e-70884. https://doi.org/10.1590/1809-6891v22e-70884.
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) apresentaram um trabalho descrevendo o princípio dos 10 Rs e a importância da sua implementação na pesquisa com zebrafish. No entanto, a abordagem de saúde única (animal, humana e ambiental), junto de uma padronização de criação, manejo e procedimentos experimentais em zebrafish no Brasil considerando os princípios éticos e legais ainda é limitada.

As Boas Práticas de Laboratório (BPL) foram regulamentadas por diversas instituições e agências no mundo como Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos (USFDA), Agência de proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) e Organização para Cooperação de Desenvolvimento Econômico (OCDE), por exemplo. Essa regulamentação promoveu um sistema de monitoramento dos estudos realizados com animais para garantir a segurança dos produtos desenvolvidos. Embora as BPL sejam amplamente empregadas em estudos envolvendo mamíferos terrestres, elas têm sido comparativamente subutilizadas na pesquisa com organismos aquáticos (1818 Wolf JC, Wolfe MJ. Good laboratory practice considerations in the use of fish models. Toxicologic Pathology. 2003;31(1):53-57. https://doi.org/10.1080/01926230390178739.
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). No Brasil, as diretrizes de Integridade e de Boas Práticas para Produção, Manutenção ou Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa Científica, estão descritas na RN nº 32/2016 do CONCEA (1919 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Resolução Normativa CONCEA nº 32, de 06 de setembro de 2016. Baixa as Diretrizes de Integridade e de Boas Práticas para Produção, Manutenção ou Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa Científica. Diário Oficial da União. 2016; seção 1, p. 5. Portuguese.). No entanto, o documento apresenta apenas os valores e princípios da condução da pesquisa científica sem uma explanação mais detalhada das recomendações particulares para cada grupo de organismos utilizados.

O objetivo deste trabalho é apresentar um padrão em conformidade com a Organização Mundial da Saúde (OMS) para a implementação das Boas Práticas de Laboratório em biotérios de zebrafish.

2. Boas Práticas de Laboratório (BPL)

As atividades realizadas em laboratório requerem do profissional uma série de cuidados, justificada pelo risco à saúde do trabalhador, bem como ao bem-estar animal e meio ambiente. A prevenção desses riscos requer a aplicação de modernos avanços tecnológicos no desenho de biotérios e nas rotinas de trabalho. Dentre estes avanços destacamos o padrão sanitário e caracterização genética dos animais e a utilização de técnicas menos invasivas. Infelizmente poucos estabelecimentos do país apresentam recursos humanos com formação apropriada e infraestrutura básica de pesquisa que inclua os centros de criação de animais de laboratório, equivalentes àqueles existentes nos Estados Unidos e na Europa (2020 Politi FAS, Majerowicz J, Cardoso TAO, Pietro RCLR, Salgado HRN. Caracterização de biotérios, legislação e padrões de biossegurança. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. 2008;29(1)17-28. https://rcfba.fcfar.unesp.br/index.php/ojs/article/view/489.
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).

As BPL são um sistema de controle de qualidade gerencial que abrange o processo organizacional e as condições sob as quais os estudos não clínicos de saúde e meio ambiente são planejados, realizados, monitorados, registrados, relatados e retidos (ou arquivados) (2121 UNDP, World Bank, WHO. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (‎GLP)‎. World Health Organization; 2001. 225p. https://apps.who.int/iris/handle/10665/66894.
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). Apesar dos avanços consideráveis no controle de qualidade, os erros originados nas investigações laboratoriais continuam a ocorrer em grandes números anualmente. Desta forma, uma estratégia adotada é a busca contínua da melhoria da qualidade por meio de diretrizes regulatórias como as BPL e que podem servir como chave para a redução de erros.

As doenças tropicais são um importante problema de saúde pública nos países em desenvolvimento. Para muitas dessas doenças não existem medicamentos novos, eficazes e acessíveis, enquanto as terapias mais antigas começam a perder terreno por conta do surgimento de resistência contra os medicamentos tradicionais. As empresas farmacêuticas multinacionais não têm tradicionalmente investido em novas formulações em seus programas de desenvolvimento, razão pela qual a OMS criou programas de pesquisa e desenvolvimento em várias áreas prioritárias, como a malária (2121 UNDP, World Bank, WHO. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (‎GLP)‎. World Health Organization; 2001. 225p. https://apps.who.int/iris/handle/10665/66894.
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). Desta forma a OMS publicou documentos sobre boas práticas de fabricação (BPF) e boas práticas clínicas (BPC), no entanto esses documentos não definem qualquer padrão de qualidade que rege as fases não clínicas do desenvolvimento de medicamento.

Na experimentação animal, as BPL abrangem a adesão aos aspectos éticos de métodos usados em experimentos com animais de laboratório, incluindo o desenho experimental, aderência às diretrizes emitidas pelos órgãos de ética animal, dosagem, número de animais utilizados em cada grupo de estudo, análise estatística significativa dos dados obtidos, medição de dados e garantia de qualidade. Para fins didáticos, as BPL foram divididas em cinco grandes tópicos conforme recomendação da OMS (2222 WHO, World Health Organization. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Good laboratory practice training manual for the trainee: A tool for training and promoting good laboratory practice (GLP) concepts in disease endemic countries. 2nd ed. World Health Organization; 2008. 268p.) descritos a seguir.

3. Recursos

3.1 Gestão de Pessoal

De forma geral, todos as normativas referentes à gestão de pessoal descrevem a equipe e os requisitos integrantes de todos os estudos de BPL, incluindo o fornecimento para gerenciamento de instalações de teste, um diretor de estudo, uma unidade de garantia de qualidade e acesso à assistência profissional (2121 UNDP, World Bank, WHO. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (‎GLP)‎. World Health Organization; 2001. 225p. https://apps.who.int/iris/handle/10665/66894.
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,2222 WHO, World Health Organization. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Good laboratory practice training manual for the trainee: A tool for training and promoting good laboratory practice (GLP) concepts in disease endemic countries. 2nd ed. World Health Organization; 2008. 268p.). Neste contexto, as exigências para o desenvolvimento de estudos com zebrafish são as mesmas empregadas para experimentos com mamíferos, por exemplo, roedores. Ou seja, devem seguir a prerrogativa de que todo o pessoal envolvido no cuidado e uso de animais deve possuir qualificação e treinamento baseados nos princípios do cuidado de animais de laboratório de forma a subsidiar o bem-estar animal e, consequentemente, a qualidade da pesquisa (1717 Canedo A, Saiki P, Santos AL, Carneiro SK, Souza, AM, Qualhato G, Brito RS, Mello-Andrade, Rocha, TL. O peixe-zebra (Danio rerio) encontra a bioética: os princípios éticos dos 10Rs na pesquisa. Ciência Animal Brasileira. 2022;23(1):e-70884. https://doi.org/10.1590/1809-6891v22e-70884.
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18 Wolf JC, Wolfe MJ. Good laboratory practice considerations in the use of fish models. Toxicologic Pathology. 2003;31(1):53-57. https://doi.org/10.1080/01926230390178739.
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19 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Resolução Normativa CONCEA nº 32, de 06 de setembro de 2016. Baixa as Diretrizes de Integridade e de Boas Práticas para Produção, Manutenção ou Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa Científica. Diário Oficial da União. 2016; seção 1, p. 5. Portuguese.

20 Politi FAS, Majerowicz J, Cardoso TAO, Pietro RCLR, Salgado HRN. Caracterização de biotérios, legislação e padrões de biossegurança. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. 2008;29(1)17-28. https://rcfba.fcfar.unesp.br/index.php/ojs/article/view/489.
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21 UNDP, World Bank, WHO. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (‎GLP)‎. World Health Organization; 2001. 225p. https://apps.who.int/iris/handle/10665/66894.
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22 WHO, World Health Organization. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Good laboratory practice training manual for the trainee: A tool for training and promoting good laboratory practice (GLP) concepts in disease endemic countries. 2nd ed. World Health Organization; 2008. 268p.
-2323 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Resolução Normativa CONCEA nº 49, de 07 de maio de 2021. Dispõe sobre a obrigatoriedade de capacitação do pessoal envolvido em atividades de ensino e pesquisa científica que utilizam animais. Diário oficial da União. 2021; seção 1, p. 5. Portuguese.).

Além disso, a necessidade de cuidados veterinários é parte essencial do uso de animais para experimentação. O foco principal do médico veterinário é supervisionar o bem-estar e os cuidados clínicos de animais usados em pesquisa, testes, ensino e produção. Essa responsabilidade se estende ao monitoramento e promoção do bem-estar animal em todos os momentos durante o uso do animal e durante todas as fases da vida do animal (2424 National Research Council (US). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington (DC): National Academies Press (US); 2011. https://nap.nationalacademies.org/catalog/12910/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals-eighth
https://nap.nationalacademies.org/catalo...
). De acordo com Kuzel et al. (2525 Kuzel MAA, Freitas TPT, Schirato GV, Souza JB, Müller CB. A importância da qualificação profissional e o trabalho em equipe no biotério de experimentação. Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. 2012;1(3):263-269. https://www.sbcal.org.br/old/upload/arqupload/artigo8numero3-2111e.pdf.
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) a orientação do médico veterinário aos técnicos e usuários reduz os riscos a que são expostos os animais e profissionais durante a experimentação.

3.2 Instalações e equipamentos

As instalações de um biotério de peixes devem apresentar um cuidado crítico com o layout a fim de maximizar a utilização do espaço disponível, facilitar o acesso e tráfego, garantir a segurança dos trabalhadores, manter as condições ambientais e estar adequada para futuras ampliações. Estes princípios gerais independem do tamanho da instalação e devem estar de acordo com o objetivo da pesquisa e o espaço disponível. Neste sentido, a instalação para manutenção de zebrafish pode variar de uma sala com alguns aquários até um centro composto por diversas salas contendo sistemas de racks com dezenas de tanques.

A criação e manutenção de zebrafish é mais exigente do que manter invertebrados, mas menos do que manter estoques de mamíferos (1414 Brand M, Granato M, Nüsslein-Volhard C. Keeping and raising zebrafish. In: Dahm R and Nüsslein-Volhard C. Zebrafish: A Practical Approach. London: IRL Press; 2002. p. 7-37.). Para um funcionamento eficiente, a prevenção de falhas é uma das preocupações primárias. Quanto maior o controle sobre influências externas como suprimento de água, suprimento de ar, comida e novos peixes, melhor a estabilidade e segurança. Isso deve ser equilibrado com considerações de espaço, custo de equipamento, mão de obra, custo de manutenção, habilidades técnicas da equipe, utilidade de pesquisa, bem como esforços investidos em uma linhagem específica de peixe (2626 Trevarrow B. Zebrafish facilities for small and large laboratories. Methods in cell biology. 2004;77:565-591. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(04)77030-2.
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). Neste contexto, a maior demanda ocorre para manter a água em boas condições. Dessa forma, podemos ter dois tipos de sistemas: (1) sem filtragem e (2) com filtragem de água (1414 Brand M, Granato M, Nüsslein-Volhard C. Keeping and raising zebrafish. In: Dahm R and Nüsslein-Volhard C. Zebrafish: A Practical Approach. London: IRL Press; 2002. p. 7-37.). No primeiro não há custos de instalação e manutenção de filtros tornando-os relativamente baratos de configurar. Por outro lado, são muito exigentes em termos de espaço, porque os peixes têm de ser mantidos em baixas densidades. Além disso, exigem alta manutenção e, na prática, funcionam apenas em áreas onde a água limpa pode ser produzida ou captada com baixo custo. Já o sistema com filtros possui elementos filtrantes e meios para a agregação de bactérias que degradam compostos tóxicos na água, permitindo a reutilização do meio de criação através da recirculação da água, da passagem contínua da água pelos diversos filtros e da constante disponibilização da água tratada para os animais.

Uma das principais vantagens dos sistemas de recirculação é que eles fornecem água de alta qualidade sem a necessidade de troca de água. Além disso, este sistema permite a criação e manutenção de um número maior de peixes em um espaço comparativamente menor. Independentemente do tipo de sistema adotado, o tipo de tanque deve permitir as necessidades fisiológicas e comportamentais normais dos animais, incluindo função excretora, controle e manutenção da temperatura corporal, movimentos típicos e ajustes posturais e, quando indicado, reprodução (2424 National Research Council (US). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington (DC): National Academies Press (US); 2011. https://nap.nationalacademies.org/catalog/12910/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals-eighth
https://nap.nationalacademies.org/catalo...
). Os sistemas de criação de zebrafish evoluíram consideravelmente nas últimas décadas devido à popularização e diversificação das pesquisas utilizando-o como modelo. Dados esses níveis crescentes de complexidade, tanto em sistemas de habitação e os usos experimentais do zebrafish, a tarefa de escolher, projetar e planejar um novo sistema ou atualizar um existente é extremamente importante para o sucesso da pesquisa. De acordo com Lawrence e Mason (2727 Lawrence C, Mason T. Zebrafish housing systems: A review of basic operating principles and considerations for design and functionality. ILAR Journal. 2012;53(2):179-191. https://doi.org/10.1093/ilar.53.2.179.
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) acima de tudo, os sistemas de habitação dos peixes selecionados devem funcionar para (1) proporcionar um ambiente estável e favorável que produz e mantém peixes saudáveis e produtivos e (2) apoiar os objetivos de pesquisa específicos da equipe de investigação.

4. Caracterização

Considerando que a água é o “ambiente” em que o peixe está e que é o meio de suporte à sua vida, a manutenção das condições adequadas é fundamental para qualidade da pesquisa e bem-estar dos peixes (2828 CCAC, Canadian Council on Animal Care. CCAC Guidelines: Zebrafish and other small, warm-water laboratory fish. 2020. 110p. https://ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/CCAC_Guidelines-Zebrafish_and_other_small_warm-water_laboratory_fish.pdf
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). Por isso, serão apresentados a seguir os principais parâmetros a serem avaliados e monitorados regularmente em um biotério que se propõe a abrigar zebrafish.

4.1 Parâmetros Abióticos

4.1.1 Temperatura

Nos peixes a temperatura afeta praticamente todos os aspectos do comportamento e da fisiologia (2929 Villamizar N, Ribas L, Piferrer F, Vera LM, Sánchez-Vázquez FJ. Impact of Daily Thermocycles on Hatching Rhythms, Larval Performance and Sex Differentiation of Zebrafish. PLoS ONE. 2012;7(12):e52153. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052153.
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). O zebrafish está classificado como um peixe euritérmico que suporta um amplo gradiente de temperaturas. No ambiente natural ele habita locais com temperatura de ~6 °C no inverno até ~38 °C no verão (3030 Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 2008;83(1):13-34. https://doi.org/10.1111/j.1469-185X.2007.00030.x.
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). Em laboratório a temperatura da sala ou água é normalmente mantida entre 26-28,5 °C (4141 Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Taddei K, Lardelli M., Groth DM, Verdile G, Martins RN. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. Journal of Visualized Experiments. 2012;69:e4196. https://doi.org/10.3791/4196.
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). No entanto, a temperatura ótima recomendada tanto para reprodução como para o desenvolvimento embrionário no laboratório é de 28,5 °C (1515 Matthews M, Trevarrow B, Matthews J. A virtual tour of the Guide for zebrafish users. Lab Animal. 2002;31(3):34-40., 3131 Bilotta, J, Saszik S, DeLorenzo AS, Hardesty HR. Establishing and maintaining a low-cost zebrafish breeding and behavioural research facility. Behaviour Research Methods, Instruments and Computers. 1999;31(1):178-184. https://doi.org/10.3758/bf03207707.
https://doi.org/10.3758/bf03207707...
). Estudos com embriões de zebrafish demostraram que o consumo de oxigênio, taxa de batimento cardíaco e toxicidade de compostos são modificados pela temperatura (3232 Osterauer R, Heinz-R. Köhler. Temperature-dependent effects of the pesticides thiacloprid and diazinon on the embryonic development of zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 2008;86:485-494. https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2007.12.013.
https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2007.1...
,3333 Barrionuevo WR, Burggren WW. O2 consumption and heart rate in developing zebrafish (Danio rerio): Influence of temperature and ambient O2. American of Journal of Physiology. 1999;276(2):R505-513. https://doi.org/10.1152/ajpregu.1999.276.2.R505.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1999.276...
). Além disso, a temperatura apresenta uma forte influência sobre a diferenciação sexual durante o desenvolvimento embrionário (2929 Villamizar N, Ribas L, Piferrer F, Vera LM, Sánchez-Vázquez FJ. Impact of Daily Thermocycles on Hatching Rhythms, Larval Performance and Sex Differentiation of Zebrafish. PLoS ONE. 2012;7(12):e52153. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052153.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.005...
). Scott e Jhonston (3434 Scott GR, Johnston IA. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012;109(35):14247-14252. https://doi.org/10.1073/pnas.1205012109.
https://doi.org/10.1073/pnas.1205012109...
) demostraram que a temperatura de incubação do embrião pode ter efeitos dramáticos e persistentes na capacidade de aclimatação térmica em vários níveis de organização biológica, desde o nível molecular até o morfológico. De acordo com Zhang et al. (3535 Zhang Q, Kopp M, Babiak I, Fernandes JMO. Low incubation temperature during early development negatively affects survival and related innate immune processes in zebrafsh larvae exposed to lipopolysaccharide. Scientific Reports. 2018;8:4142. https://doi.org/10.1038/s41598-018-22288-8.
https://doi.org/10.1038/s41598-018-22288...
), larvas incubadas a temperaturas mais baixas (24 °C) durante o desenvolvimento inicial têm uma piora na taxa de sobrevivência e em processos da imunidade inata.

4.1.2 Fotoperíodo

Embora zebrafish tenha sido descrito como uma espécie diurna (3636 Hurd MW, Debruyne J, Straume M, Cahill GM. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiology & Behavior. 1998;65(3):465-472. https://doi.org/10.1016/S0031-9384(98)00183-8.
https://doi.org/10.1016/S0031-9384(98)00...
), estudos posteriores revelaram que a espécie é capaz de exibir ritmos comportamentais diurnos ou noturnos dependendo das condições de criação (como alimentação e ciclos de temperatura) (3737 López-Olmeda JF, Madrid JA, Sánchez-Vázquez FJ. Light and temperature cycles as zeitgebers of zebrafish (Danio rerio) circadian activity rhythms. Chronobiology International. 2006;23(3):537-550. https://doi.org/10.1080/07420520600651065.
https://doi.org/10.1080/0742052060065106...
,3838 del Pozo A, Sánchez-Férez JA, Sánchez-Vázquez FJ. Circadian rhythms of self-feeding and locomotor activity in zebrafish (Danio rerio). Chronobiology International. 2011;28(1):39-47. https://doi.org/10.3109/07420528.2010.530728.
https://doi.org/10.3109/07420528.2010.53...
). No entanto, o fotoperíodo apresenta uma forte influência sobre o comportamento reprodutivo de zebrafish (4040 Lawrence C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 2007;269:1-20. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.077.
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20...
). Em laboratório, o zebrafish geralmente desova nas primeiras horas de luz do dia. De acordo com Francis (3939 Francis, M. Aquatics labs: five questions you don’t want to have to ask. Canadian Association for Laboratory Animal Science/Association Canadienne pour la Science des Animaux de Laboratoire membership magazine. 2008;42(3):25-27.), uma das maneiras mais rápidas de garantir que os peixes não realizem oviposição é manter as luzes acesas por tempo integral. Assim, o ciclo circadiano ideal de luz no laboratório para o zebrafish é geralmente definido em 14 horas de luz e 10 horas de escuridão completa (1515 Matthews M, Trevarrow B, Matthews J. A virtual tour of the Guide for zebrafish users. Lab Animal. 2002;31(3):34-40.). Este ciclo de claro-escuro imita o ambiente natural sendo o ideal para manutenção do relógio circadiano do zebrafish.

4.1.3 Qualidade da água

Os parâmetros de qualidade da água afetam diretamente os organismos sendo necessário mantê-los dentro dos níveis adequados para a espécie de cultivo. A manutenção dos animais em condições de água inadequada faz com que os organismos alterem sua condição fisiológica podendo levar ao surgimento de doenças, surtos epizoóticos, baixo crescimento, falhas reprodutivas e mortalidade (2828 CCAC, Canadian Council on Animal Care. CCAC Guidelines: Zebrafish and other small, warm-water laboratory fish. 2020. 110p. https://ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/CCAC_Guidelines-Zebrafish_and_other_small_warm-water_laboratory_fish.pdf
https://ccac.ca/Documents/Standards/Guid...
).

Independentemente do tipo de sistema de criação adotado, os parâmetros de qualidade da água devem seguir um controle rígido conforme descritos a seguir.

4.1.4 pH

O pH da água nos sistemas aquáticos exerce um profundo efeito nos processos fisiológicos dos peixes assim como no funcionamento da comunidade microbiana que os suporta. Além disso, a toxicidade de alguns compostos como amônia, nitrito, metais e medicamentos são fortemente influenciados pelo pH da água (4242 Boström ML, Berglund O. Influence of pH-dependent aquatic toxicity of ionizable pharmaceuticals on risk assessments over environmental pH ranges. Water Research. 2015; 72:154-161. https://doi.org/10.1016/j.watres.2014.08.040.
https://doi.org/10.1016/j.watres.2014.08...

43 Magalhães DP, Marques MRC, Baptista DF, Buss DF. Metal bioavailability and toxicity in freshwaters. Environmental Chemistry Letters. 2015;13:69-87. https://doi.org/10.1007/s10311-015-0491-9.
https://doi.org/10.1007/s10311-015-0491-...
-4444 Martinelle K, Häggström L. Mechanisms of ammonia and ammonium ion toxicity in animal cells: Transport across cell membranes, Journal of Biotechnology. 1993;30(3):339-350. https://doi.org/10.1016/0168-1656(93)90148-G
https://doi.org/10.1016/0168-1656(93)901...
). Na maioria dos laboratórios o nível do pH é mantido entre 7.0 e 8.0 (4040 Lawrence C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 2007;269:1-20. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.077.
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20...
). Brand et al. (1818 Wolf JC, Wolfe MJ. Good laboratory practice considerations in the use of fish models. Toxicologic Pathology. 2003;31(1):53-57. https://doi.org/10.1080/01926230390178739.
https://doi.org/10.1080/0192623039017873...
) sugerem um nível mais restrito entre 6.8 e 7.5 (nunca abaixo de 6.0 ou maior que 8.0).

4.1.5 Alcalinidade

A alcalinidade representa a medida de todas as bases tituláveis presentes na água. Ela descreve a capacidade da água de neutralizar ácidos fortes, o que ajuda a manter a estabilidade do pH. Em geral, é recomendável manter os valores de alcalinidade dentro de uma faixa de 50-150 mg de CaCO3/L (4141 Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Taddei K, Lardelli M., Groth DM, Verdile G, Martins RN. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. Journal of Visualized Experiments. 2012;69:e4196. https://doi.org/10.3791/4196.
https://doi.org/10.3791/4196...
).

4.1.6 Dureza

A dureza da água é uma medida da quantidade de íons divalentes principalmente cálcio e magnésio, e em menor grau, ferro e selênio (4545 Wurts WA. Alkalinity and hardness in production ponds. World Aquaculture. 2002; 33:16-17.). Os peixes requerem esses íons para as funções fisiológicas, e eles devem ser fornecidos na água e/ou na dieta aos peixes em cativeiro. O zebrafish é considerado um peixe de “água dura” preferindo água com concentrações acima de 100 mg de CaCO3/L. De acordo com Lawrence (4040 Lawrence C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 2007;269:1-20. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.077.
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) é recomendável manter os valores de dureza dentro de uma faixa de 75-200 mg de CaCO3/L sendo a mesma faixa geralmente recomenda para uma gama de peixes de água doce.

4.1.7 Compostos nitrogenados

O nitrogênio amoniacal total consiste em dois compostos, a amônia ionizada (NH4+), denominada íon amônio, e a não ionizada (NH3), amplamente conhecida como amônia. A razão relativa à proporção de cada umas das formas de amônia depende do pH, temperatura e salinidade (4646 Timmons MB, Ebeling JM, Wheaton JM, Summerelt ST, Vinci BJ. Recirculating Aquaculture Systems. 2nd ed. Ithaca (NY): Cayuga Aqua Ventures; 2002. 757p.). O principal produto metabólico excretado pelos peixes é a amônia que é eliminada através do epitélio branquial por difusão e em menor quantidade pelas fezes. A produção de amônia também ocorre durante a decomposição da matéria orgânica (principalmente fezes, alimentos não consumidos e peixes mortos) por bactérias (2727 Lawrence C, Mason T. Zebrafish housing systems: A review of basic operating principles and considerations for design and functionality. ILAR Journal. 2012;53(2):179-191. https://doi.org/10.1093/ilar.53.2.179.
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). A amônia não ionizada é altamente tóxica para os peixes devendo ser retirada do sistema. Níveis de amônia acima de 0,02 ppm devem ser evitados (4141 Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Taddei K, Lardelli M., Groth DM, Verdile G, Martins RN. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. Journal of Visualized Experiments. 2012;69:e4196. https://doi.org/10.3791/4196.
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). Em sistemas de recirculação, esses níveis são atingidos através da oxidação da amônia a nitrito e em seguida a nitrato por devido a ação de bactérias nitrificantes em um processo conhecido por nitrificação. O produto intermediário desta conversão, o nitrito também é tóxico para os peixes e pode ser problemático em concentrações superiores a 0,1 ppm (4141 Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Taddei K, Lardelli M., Groth DM, Verdile G, Martins RN. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. Journal of Visualized Experiments. 2012;69:e4196. https://doi.org/10.3791/4196.
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). A toxicidade pelo nitrato ocorre apenas em concentrações muito altas. Dessa forma, recomendam-se trocas parciais de água como rotina de manutenção a fim de manter o nível de nitrato menor que 50 mg/L (4141 Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Taddei K, Lardelli M., Groth DM, Verdile G, Martins RN. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. Journal of Visualized Experiments. 2012;69:e4196. https://doi.org/10.3791/4196.
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).

4.1.8 Oxigênio

Baixos níveis de oxigênio dissolvido são os maiores responsáveis por mortalidade de peixes em cultivo do que qualquer outro parâmetro (4646 Timmons MB, Ebeling JM, Wheaton JM, Summerelt ST, Vinci BJ. Recirculating Aquaculture Systems. 2nd ed. Ithaca (NY): Cayuga Aqua Ventures; 2002. 757p.). A solubilidade do oxigênio varia de acordo com a pressão atmosférica, sais e temperatura. Temperaturas elevadas reduzem a solubilidade de oxigênio na água. Em cultivo de zebrafish, a temperatura relativamente alta de manutenção, a densidade de animais nos aquários e a alta frequência de alimentação típica de instalações de alta atividade criam a necessidade de níveis de oxigênio dissolvido próximos da saturação (~7,8 mg/L em 28 ºC) (4040 Lawrence C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 2007;269:1-20. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.077.
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).

4.1.9 Salinidade e condutividade

A salinidade é medida em partes por mil ou da capacidade da água em conduzir eletricidade (condutividade) expressa em microSiemens por centímetro (μS/cm). Os níveis de salinidade devem ser estáveis e mantidos < 5 g/L (2727 Lawrence C, Mason T. Zebrafish housing systems: A review of basic operating principles and considerations for design and functionality. ILAR Journal. 2012;53(2):179-191. https://doi.org/10.1093/ilar.53.2.179.
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). A maioria dos sistemas de zebrafish usa água do sistema de abastecimento urbano sem cloro; no entanto, alguns sistemas utilizam água deionizada. A condutividade deve ser de 150-1700 μS/cm (4747 Aleström P, D’Angelo L, Midtlyng PJ, Schorderet DF, Schulte-Merker S, Sohm F, Warner S. Zebrafish: Housing and Husbandry Recommendations. Laboratory Animals. 2020;54(3):213-24. https://doi.org/10.1177/0023677219869037.
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), embora seja recomendado um intervalo mais estreito de 300-1.500 μS/cm, de acordo com o recomendado por Avdesh et al. (4141 Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Taddei K, Lardelli M., Groth DM, Verdile G, Martins RN. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. Journal of Visualized Experiments. 2012;69:e4196. https://doi.org/10.3791/4196.
https://doi.org/10.3791/4196...
).

4.1.10 Fonte da água

Especial cuidado deve ser tomado com as fontes da água de abastecimento dos biotérios de criação e manutenção do zebrafish. Apesar dos sistemas de filtração serem uma opção para o tratamento da água captada, muitos contaminantes não são removidos por esses sistemas. Existem muitos relatos dos impactos sobre o comportamento, a fisiologia, a reprodução e o desenvolvimento do zebrafish tanto para resíduos de medicamentos (4848 Kalichak F, Barcellos HHA, Idalencio R, Koakoski G, Soares SM, Pompermaier A, Rossini M, Barcellos LJG. Persistent and transgenerational effects of risperidone in zebrafish. Environmental Science and Pollution Research. 2019;26:26293-26303. https://doi.org/10.1007/s11356-019-05890-9.
https://doi.org/10.1007/s11356-019-05890...
,4949 Tamagno WA, Sofiatti, JRO, Alves C, Sutorillo NT, Vanin AP, Bilibio D, Pompermaier A, Barcellos LJG. Synthetic estrogen bioaccumulates and changes the behavior and biochemical biomarkers in adult zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2022;92:103857. https://doi.org/10.1016/j.etap.2022.103857.
https://doi.org/10.1016/j.etap.2022.1038...
), quanto para agroquímicos (5050 Chaulet FC, HHA Barcellos, Fior D, Pompermaier A, Koakoski G, Rosa JGS, Fagundes M, Barcellos LJG. Glyphosate- and Fipronil-Based Agrochemicals and Their Mixtures Change Zebrafish Behavior. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 2019;77:443-451. https://doi.org/10.1007/s00244-019-00644-7.
https://doi.org/10.1007/s00244-019-00644...
).

4.2 Manuseio e contenção

Quase todos os peixes mantidos em laboratório precisam ser manuseados fisicamente em algum momento devendo-se considerar que esse é um evento estressante para os peixes. Atividades como exposição ao ar, transferência de tanques, isolamento social, manejo reprodutivo, anestesia, coleta de sangue e sêmen entre outras são episódios causadores de estresse. Cada atividade de manuseio se caracteriza por uma intensidade e frequência, desta forma a sua influência nos resultados experimentais deve ser considerada ao se planejar um experimento. Mesmo em episódios de estresse agudo os peixes podem demorar algumas horas até retomarem o seu estado inicial. De fato, muitas das atividades rotineiras de um biotério de manutenção de peixes, como a perseguição e captura com rede, a transferência de aquários e a exposição ao ar são estressantes para o zebrafish, sendo, inclusive, usadas em protocolos de estresse padrão (5151 Barcellos HHA, Pompermaier A, Mendonça-Soares S, Maffi VC, Fernandes M, Koakoski G, Kirsten K, Baldisserotto B, Barcellos LJG. Aripiprazole prevents stress-induced anxiety and social impairment, but impairs antipredatory behavior in zebrafish. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 2020;189:172841. https://doi.org/10.1016/j.pbb.2019.172841.
https://doi.org/10.1016/j.pbb.2019.17284...

52 Giacomini ACVV, Abreu MS, Giacomini LV, Siebel AM, Zimerman FF, Rambo CL, Mocelin R, Bonan CD, Piato AL, Barcellos LJG. Fluoxetine and diazepam acutely modulate stress induced-behavior. Behavioural Brain Research. 2016;296:301-310. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2015.09.027.
https://doi.org/10.1016/j.bbr.2015.09.02...

53 Abreu MS, Koakoski G, Ferreira D, Oliveira TA, Rosa JGS, Gusso D, Giacomini ACV, Piato AL, Barcellos LJG. Diazepam and Fluoxetine Decrease the Stress Response in Zebrafish. PLoS ONE. 2014;9(7):e103232. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103232.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.010...

54 Quadros VA, Rosa LV, Costa FV, Koakoski G, Barcellos LJG, Rosemberg DB. Predictable chronic stress modulates behavioral and neuroendocrine phenotypes of zebrafish: Influence of two homotypic stressors on stress-mediated responses. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology & Pharmacology. 2021;247:109030. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2021.109030.
https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2021.1090...
-5555 Kirsten K, Pompermaier A, Koakoski G, Mendonça-Soares S, da Costa AR, Maffi VC, Kreutz LC, Barcellos LJG. Acute and chronic stress differently alter the expression of cytokine and neuronal markers genes in zebrafish brain. Stress. 2021;24(1):107-112. https://doi.org/10.1080/10253890.2020.1724947.
https://doi.org/10.1080/10253890.2020.17...
).

Zebrafish submetidos a diferentes tipos de estressores crônicos apresentam mudanças fisiológicas e de comportamento (5454 Quadros VA, Rosa LV, Costa FV, Koakoski G, Barcellos LJG, Rosemberg DB. Predictable chronic stress modulates behavioral and neuroendocrine phenotypes of zebrafish: Influence of two homotypic stressors on stress-mediated responses. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology & Pharmacology. 2021;247:109030. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2021.109030.
https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2021.1090...
). Além disso, Kirsten et al. (5555 Kirsten K, Pompermaier A, Koakoski G, Mendonça-Soares S, da Costa AR, Maffi VC, Kreutz LC, Barcellos LJG. Acute and chronic stress differently alter the expression of cytokine and neuronal markers genes in zebrafish brain. Stress. 2021;24(1):107-112. https://doi.org/10.1080/10253890.2020.1724947.
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) demostraram que o estressecrônico ativa alguns genes relacionados a resposta pró-infamatória em zebrafish. Desta forma, a exposição ao estresse crônico pode ser minimizada por meio de treinamento de pessoal, padronização na rotina de manejo e aclimatação. De acordo com a recomendação da Canadian Council on Animal Care (CCAC) (2828 CCAC, Canadian Council on Animal Care. CCAC Guidelines: Zebrafish and other small, warm-water laboratory fish. 2020. 110p. https://ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/CCAC_Guidelines-Zebrafish_and_other_small_warm-water_laboratory_fish.pdf
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) “os peixes devem ser manuseados somente quando necessário e o número de episódios envolvendo o manuseio deve ser minimizado.”

4.3 Densidade populacional

A densidade de estocagem dos peixes é influenciada por fatores como qualidade da água, alimento, taxa de alimentação, tamanho e idade dos peixes. A otimização destes fatores varia de um biotério para outro. Os adultos podem ser mantidos a uma densidade de 5-8 peixes/L. Os juvenis (< 45 dias) podem ser alojados em uma densidade mais alta. A Tabela 1 apresenta as recomendações de densidade de acordo com alguns estudos. Contudo, no momento, não há informações suficientes sobre a densidade adequada para peixes jovens em desenvolvimento. Se o crescimento ou a saúde dos peixes não são os esperados, a densidade deve ser modificada.

Tabela 1
Principais recomendações sobre densidade de manutenção de zebrafish (Danio rerio). Adaptado do Conselho Canadense para Proteção Animal (2828 CCAC, Canadian Council on Animal Care. CCAC Guidelines: Zebrafish and other small, warm-water laboratory fish. 2020. 110p. https://ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/CCAC_Guidelines-Zebrafish_and_other_small_warm-water_laboratory_fish.pdf
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).

4.4 Alimentação

De todos os aspectos da criação e manejo de zebrafish, a nutrição foi a que apesentou menor desenvolvimento apesar da grande popularização de zebrafish como modelo biomédico. Os protocolos “padrão” de nutrição para o zebrafish, citados em várias publicações, geralmente descrevem a administração de uma dieta composta por náuplios de Artemia spp. e ração processada, geralmente floculada desenvolvida para peixes tropicais (2727 Lawrence C, Mason T. Zebrafish housing systems: A review of basic operating principles and considerations for design and functionality. ILAR Journal. 2012;53(2):179-191. https://doi.org/10.1093/ilar.53.2.179.
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,5757 Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. Eugene: University of Oregon Press; 2000.). Devido à escassez de informações específicas sobre os requisitos nutricionais de zebrafish pode ser imprudente alimentar exclusivamente com dieta artificial. Na natureza, os zebrafish alimentam-se de pequenos crustáceos e larvas de insetos. Dessa forma, a oferta de alimento vivo permite que os peixes expressem o comportamento natural da espécie e supre a necessidade de busca ativa e captura do alimento, enquadrando-se como uma medida de incremento ao enriquecimento ambiental. Em laboratório, os alimentos vivos mais comumente utilizados são paramécio, rotíferos e náuplios de Artemia spp.

A quantidade de ração oferecida em cada alimentação e a frequência são importantes componentes dos protocolos de alimentação, e muitas vezes são específicas de acordo com o objetivo a ser atingido, como, por exemplo, crescimento, reprodução ou manutenção. Em termos de taxa de alimentação, existem duas abordagens gerais utilizadas nos cuidados de zebrafish: (1) alimentação até a saciedade (ad libitum) e (2) alimentação proporcional ao peso corporal. Nos guias de cuidado com zebrafish, a taxa de alimentação que é recomendada varia de 3-8% do peso corporal/ de ração/dia (5959 Geisler R, Borel N, Ferg M, Maier JV, Strähle U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 2016;13(S1):S19-S23. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1205.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1205...
). De acordo com Lawrence (2626 Trevarrow B. Zebrafish facilities for small and large laboratories. Methods in cell biology. 2004;77:565-591. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(04)77030-2.
https://doi.org/10.1016/S0091-679X(04)77...
), a frequência de alimentação deve ser contínua desde de 5 a 14 dpf (dias pós-fertilização) passando para 3-5 vezes ao dia de 15 até 60 dpf e, finalmente, 1-3 vezes ao dia após 60 dpf. Outro fator importante na criação de zebrafish é o tamanho do alimento. A alimentação das larvas deve começar a partir de 5 dpf, pois nesse período do desenvolvimento o sistema digestório já está aberto nas duas extremidades e o vitelo está quase ou totalmente consumido (1616 Reed B, Jennings M. Guidance on housing and care of zebrafish Danio rerio. Horsham: Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA); 2011. 64p. (https://norecopa.no/no/textbase/guidance-on-the-housing-and-care-of-zebrafish-danio-rerio)
https://norecopa.no/no/textbase/guidance...
). A transição de alimentação endógena para exógena e de alimento vivo para ração são períodos críticos para a larvicultura. Durante esse período é importante o oferecimento de invertebrados como Paramecium spp., Brachionus plicatilis e náuplios de Artemia spp. Já as larvas jovens podem ser alimentadas com alimentos secos de ~100 µm de tamanho (por exemplo, ZM-100, ZM systems, Reino Unido) e alimentos vivos como paramécios e rotíferos (que estimulam o crescimento). O tamanho do alimento pode ser aumentado lentamente para 200 µm (por exemplo, ZM-200, ZM systems, Reino Unido) ou 300/400 µm (por exemplo, ZM-300, ZM systems, Reino Unido) (4040 Lawrence C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 2007;269:1-20. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.077.
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20...
).

Além dos aspectos nutricionais relativos à composição das dietas utilizadas para o zebrafish, tão ou mais relevante é o manejo alimentar dos estoques de peixes, pois sabe-se que tanto a frequência alimentar utilizada quanto o intervalo de tempo entre os testes comportamentais e a última alimentação, podem interferir fortemente no comportamento do zebrafish (6060 AFS, American Fisheries Society. Guidelines for the use of fishes in research. American Fish Society. Bethesda, 2014. 90 p.). Assim, é muito importante padronizar e relatar fielmente o protocolo utilizado para evitar vieses, especialmente nos experimentos que avaliam as respostas comportamentais dos peixes a estímulos de diferentes naturezas.

4.5 Reprodução

A reprodução é um processo complexo influenciado por vários fatores, comportamentais e abióticos. Os fatores comportamentais, como a escolha do companheiro, são determinados pelo comportamento de coorte e estão relacionados à interação e percepção de uma variedade de elementos, incluindo percepção visual, tátil/auditiva (pela linha lateral) e olfativa. Os fatores abióticos do meio ambiente, incluem a qualidade da água, temperatura, fotoperíodo, alimentação, enriquecimento ambiental e tamanho do tanque (6161 Dametto FS, Fior D, Idalencio R, Rosa JGS, Fagundes M, Marqueze A, Barreto RE, Piato A, Barcellos LJG. Feeding regimen modulates zebrafish behavior. PeerJ. 2018;6:e5343. https://doi.org/10.7717/peerj.5343.
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). O primeiro passo para a reprodução é a sexagem dos indivíduos. Em condições ideais zebrafish atinge a maturidade sexual por volta de 3 a 4 meses (6262 Nasiadka A, Matthew DC. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 2012;53(2):161-168. https://doi.org/10.1093/ilar.53.2.161.
https://doi.org/10.1093/ilar.53.2.161...
). Zebrafish adultos não possuem um dimorfismo sexual bem visível. Em geral, o dimorfismo só pode ser observado em indivíduos no estágio adulto já bem desenvolvido. Nesse estágio pode-se distinguir as seguintes características: machos possuem o corpo mais delgado e curto; nadadeira anal com coloração mais vibrante (amarelo alaranjada); raios da nadadeira peitoral com a coloração amarelada. Já as fêmeas têm o corpo mais roliço e comprido com ventre mais claro e distendido; presença de uma pequena papila genital e nadadeiras peitorais com raios mais tênues; ausência de coloração vibrante na nadadeira anal; raios da nadadeira peitoral de cor pálida (6363 Duff NM, Sommerfeld RE, Litvak MK. Discriminating Sex in Zebrafish (Danio rerio) Using Geometric Morphometrics. Zebrafish. 2019;16(2):207-213. https://doi.org/10.1089/zeb.2018.1664.
https://doi.org/10.1089/zeb.2018.1664...
). De acordo com McMillan et al. (6464 McMillan SC, Géraudie J, Akimenko M-A. Pectoral Fin Breeding Tubercle Clusters: A Method to Determine Zebrafish Sex. Zebrafish. 2015;12(1):121-123. https://doi.org/10.1089/zeb.2014.1060.
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) um método prático de diferenciação sexual é a presença de tubérculos nos raios da nadadeira peitoral dos machos. De acordo com estes autores estes tubérculos se desenvolvem após a maturação sexual.

De acordo com Hutter et al. (6565 Hutter S, Penn DJ, Magee S, Zala SM. Reproductive behaviour of wild zebrafish (Danio rerio) in large tanks. Behaviour. 2010;147:641-660. https://doi.org/10.1163/000579510X12632972473944.
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) em tanques grandes os peixes geralmente formam pares em vez de grupos, demonstrando uma seleção sexual enquanto em aquários convencionais com altas densidades, a desova em grupo é mais comum. Um fator importante a ser considerado no manejo reprodutivo de colônias de zebrafish é a consanguinidade e deriva genética devendo-se sempre primar pelo aumento da diversidade genética.

Para o acasalamento, geralmente os peixes são alojados à tarde ou no começo da noite no tanque de desova e mantidos até a manhã seguinte. Se os embriões coletados precisam ser sincronizados com precisão no mesmo estágio de desenvolvimento, um casal pode ser separado por um divisor plástico no tanque. Este divisor é removido na primeira hora de luz para que ocorra a desova e fertilização dos ovos. A utilização de grupo ou par para o acasalamento deve considerar o design do tanque como tamanho e forma. Outra consideração importante é a densidade de peixes utilizada pois influencia a qualidade da água. As recomendações de manutenção e reprodução de zebrafish estão sumarizadas a seguir (Quadro 1).

Quadro 1
Principais recomendações sobre a reprodução de zebrafish (Danio rerio).

4.6 Higiene e profilaxia

Um ambiente limpo é essencial para manter um elevado padrão de saúde e bem-estar animal. Para alcançar esse objetivo, cuidados especiais devem ser tomados para evitar infecções cruzadas durante os procedimentos de criação e rotina, uma vez que muitas doenças podem ser transmitidas através do contato físico entre peixes individuais, tanques e sistemas de água. Qualquer fômite ou equipamento em contato físico com os peixes (como redes, caixas de acasalamento, aquecedores etc.) deve ser utilizado em apenas um sistema e higienizados/desinfetados periodicamente (4646 Timmons MB, Ebeling JM, Wheaton JM, Summerelt ST, Vinci BJ. Recirculating Aquaculture Systems. 2nd ed. Ithaca (NY): Cayuga Aqua Ventures; 2002. 757p.).

O acúmulo de resíduos pode estimular o crescimento de algas e cianobactérias, bem como de outros organismos que podem ser patogênicos para os peixes. Alguns projetos são mais eficientes que outros na remoção de resíduos, em qualquer caso, alguns resíduos sólidos serão acumulados e exigindo a limpeza ou substituição do tanque (2626 Trevarrow B. Zebrafish facilities for small and large laboratories. Methods in cell biology. 2004;77:565-591. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(04)77030-2.
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). A limpeza dos aquários e dos filtros é uma das características mais importantes para manter os peixes saudáveis e em condições de reprodução. Para evitar a propagação de doenças, todos os recipientes e ferramentas com que o peixe possa entrar em contato devem ser mantidos limpos (1414 Brand M, Granato M, Nüsslein-Volhard C. Keeping and raising zebrafish. In: Dahm R and Nüsslein-Volhard C. Zebrafish: A Practical Approach. London: IRL Press; 2002. p. 7-37.). Todas as recomendações para práticas de limpeza serão influenciadas não apenas pelo tipo de tanque ou sistema, mas também pelo regime de alimentação e qualidade da água que entra no sistema.

Especificamente sobre a higienização dos utensílios, é imperativo que todos os fômites usados na criação de zebrafish se mantenham livres de detergentes, visto que esses produtos são complexos, contendo muitos compostos distintos e apresentam toxicidade elevada para zebrafish (6666 Pham LN, Kanther M, Semova I, Rawls JF. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 2008;3(12):1862-1875. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.186.
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,6767 Han J-H, Jung S-K. Toxicity Evaluation of Household Detergents and Surfactants Using Zebrafish. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2021;26(1):156-164. https://doi.org/10.1007/s12257-020-0109-3.
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). Ao invés de detergentes, soluções de cloro podem ser utilizadas para a lavagem de artigos feitos de plástico e de vidro, por exemplo (6666 Pham LN, Kanther M, Semova I, Rawls JF. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 2008;3(12):1862-1875. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.186.
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). É importante salientar que o hipoclorito de sódio é o composto a base de cloro mais utilizado para desinfecção ao redor do mundo, porém esse composto pode liberar gás cloro como resultado da exposição em algum grau à matéria orgânica, à luz ultravioleta (UV) ou do contato com algumas superfícies metálicas. O gás cloro é extremamente irritante para os olhos e para o trato respiratório, se tornando um risco para quem frequenta o biotério (6868 Nickmilder M, Carbonnelle S, House BA. House cleaning with chlorine bleach and the risks of allergic and respiratory diseases in children. Pediatric Allergy and Immunology. 2007; 18(1):27-35. https://doi.org/10.1111/j.1399-3038.2006.00487.x.
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). Além disso, é sabido que o hipoclorito de sódio é corrosivo para metais (6969 Berutti E, Angelini E, Rigolone M, Migliaretti G, Pasqualini D. Influence of sodium hypochlorite on fracture properties and corrosion of ProTaper Rotary instruments. International Endodontic Journal. 2006;39:693-699. https://doi.org/10.1111/j.1365-2591.2006.01134.x.
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), o que pode ser danoso para certos utensílios e equipamentos sanitizados através do uso prolongado desse composto. Recentemente o ácido peracético vem sendo cogitado como um substituto eficiente e mais seguro ao hipoclorito de sódio, inclusive aplicado à aquicultura, sendo a dose dependente da alcalinidade e dureza da água utilizada (7070 Liu D, Pellicer AM, Brüggmann A, Kiggen M, Behrens S, Good C, Straus DL, Meinelt T. Effect of water hardness/alkalinity and humic substances on the toxicity of peracetic acid to zebrafish embryos and pathogenic isolates. Aquaculture Reports. 2021;21:100900. https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2021.100900.
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). Ainda, a desinfecção com etanol 70%, a autoclavagem e a irradiação por luz UV continuam sendo boas opções para o uso em materiais que suportam esses processos.

Vários métodos de limpeza e desinfecção de fômites já foram propostos especificamente para instalações que mantém zebrafish. Garcia e Sanders (7171 Garcia RL, Sanders GE. Efficacy of cleaning and disinfection procedures in a zebrafish (Danio rerio) facility. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2011;50(6):895-900. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3228927/.
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) propõem dois protocolos para limpeza e desinfecção de fômites usados na criação de zebrafish. O primeiro deles é direcionado para materiais que não absorvem e não se deterioram com o cloro e são fáceis de secar, como tanques e suas tampas, aparatos usados para alimentação dos animais e outros materiais diversos. Esse protocolo estabelece uma lavagem inicial com água deionizada por osmose reversa sob pressão, imersão por 30 minutos em solução desinfetante de cloro a 1,98% (Clorox® 5,25% diluído em água deionizada), novo enxague com água deionizada e secagem natural. O Outro protocolo é direcionado para redes e puçás usados rotineiramente para a manipulação dos peixes, as quais são difíceis de secar (devido à alta demanda e rotatividade) e absorvem o cloro, que é tóxico mesmo em baixas quantidades para os peixes. Além disso, esses utensílios são feitos de finos filamentos de nylon, que se deteriora ao entrar em contato com o cloro. Esse protocolo estabelece uma lavagem inicial com água deionizada sob pressão, imersão por 1 hora em solução desinfetante comercial para aquarismo (Net Soak, Jungle Labs, USA, 4,93 mL/3,8 L de água deionizada, ingredientes ativos: cloreto de banzalcônio e azul de metileno) e novo enxague com água deionizada. O banho de solução desinfetante para puçás é mantido em baldes opacos e tampados quando não estão em uso para evitar a incidência de luz e evaporação. O banho desinfetante é substituído uma vez por semana.

Chang et al. (7272 Chang CT, Colicino EG, DiPaola EJ, Al-Hasnawi HJ, Whipps CM. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology & Pharmacology. 2015;178:45-50. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2015.09.008.
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) testaram a efetividade de soluções de cloro (Clorox®); peróxido de hidrogênio e iodo povidona (PVPI) contra Mycobacterium spp., um grupo de bactérias muito prevalente em colônias de zebrafish (ver adiante). Dos tratamentos testados, a desinfecção com 25 ppm de PVPI por 5 minutos foi a mais efetiva (< 1% de sobrevivência) contra M. abscessus. Já a desinfecção com solução de cloro a 100 ppm por 10 minutos foi a menos efetiva. Contra M. chelonae, a desinfecção mais efetiva (< 1% de sobrevivência) usou solução de cloro a 150 ppm e PVPI a 100 ppm, ambas por 5 minutos. Ainda para M. chelonae o protocolo menos efetivo usou PVPI a 12,5 ppm por 5 minutos. Por fim, os autores avaliaram a efetividade desses 3 agentes desinfetantes para M. gordonae, sendo o desinfetante mais efetivo o cloro a 150 ppm por 10 minutos e o PVPI a 25 ppm por 5 minutos. Já o protocolo menos efetivo usou peróxido de hidrogênio a 1,5% por 5 minutos.

Outro agente infeccioso muito prevalente, o microsporídio Pseudoloma neurophilia, tem > 95% dos seus esporos inativados após o tratamento com cloro a 100 ppm por 10 minutos. Quando o pH da solução é ajustado para 7 com ácido acético glacial a efetividade da desinfecção aumenta e > 99% dos esporos são inativados (7373 Ferguson JA, Watral V, Schwindt AR, Kent ML. Spores of two fish microsporidia (Pseudoloma neurophilia and Glugea anomala) are highly resistant to chlorine. Diseases of Aquatic Organisms. 2007;76(3):205-214. https://doi.org/10.3354/dao076205.
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).

Com base no exposto se pode perceber que vários princípios ativos podem ser usados para impedir a proliferação de microrganismos indesejáveis em um biotério de zebrafish. Contudo, a efetividade do método utilizado dependerá de fatores como os parâmetros da solução, como a concentração utilizada e o pH, microrganismo a que se destina o tratamento, tempo de exposição dos fômites ao agente desinfetante, composição material do fômite e armazenamento e substituição adequados da solução desinfetante. Além disso, quando mais de um microrganismo for alvo específico do tratamento, uma associação de protocolos pode ser adotada. Por exemplo, como já demonstrado, a desinfecção de utensílios com 100 ppm de cloro por 10 minutos é extremamente efetiva contra P. neurophilia, mas deixa bastante a desejar em se tratando de M. abscessus. Neste sentido, cada laboratório deve desenvolver seu protocolo de limpeza e manutenção contendo os procedimentos de operação padrão para essas rotinas.

4.7 Origem dos animais

Todo e qualquer fornecedor de zebrafish no território brasileiro, seja para fins científicos ou apenas para aquariofilia doméstica, deve contar com médico veterinário como responsável técnico pelos animais (6666 Pham LN, Kanther M, Semova I, Rawls JF. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 2008;3(12):1862-1875. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.186.
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). Ainda, é importante que o fornecedor seja consultado sobre a prática de bleaching antes do envio de ovos de determinada linhagem (7676 Borges AC, Pereira N, Franco M, Vale L, Pereira M, Cunha MV, Amaro A, Albuquerque T, Rebelo M. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 2016;13(S1):1-12. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230.
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). Originalmente o bleaching foi proposto como um método de desinfecção de ovos usando cloro como princípio ativo. Westerfield et al. (5757 Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. Eugene: University of Oregon Press; 2000.) recomendam uma solução de bleaching contendo cerca de 0,003% de cloro. No protocolo desses autores 4 recipientes são preparados, 2 com a solução de bleaching e 2 com água do sistema de criação do biotério. Os embriões são coletados e dispostos em uma peneira, que passará pela sequência de banhos de forma a submergir e emergir todos os embriões com celeridade e ao mesmo tempo. Os embriões são submersos no primeiro banho, que contém a solução de bleaching, por 5 minutos. Logo em seguida os embriões são postos em um banho com água do sistema. O processo é repetido uma vez mais, de forma a utilizar todos os 4 recipientes preparados. O protocolo proposto por Brand et al. (1818 Wolf JC, Wolfe MJ. Good laboratory practice considerations in the use of fish models. Toxicologic Pathology. 2003;31(1):53-57. https://doi.org/10.1080/01926230390178739.
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) apresenta pequenas variações no procedimento descrito. Esse protocolo usa solução de bleaching contendo entre 0,0038 e 0,0049% de hipoclorito de sódio. Ao invés de 4 banhos, esse protocolo utiliza 5 banhos na seguinte sequência: banho de bleaching; banho de água da torneira; novo banho de bleaching; novo banho de água da torneira e, por fim, mais um banho de água da torneira. Cada banho é aplicado por 5 minutos. Após os banhos, os embriões devem ser lavados com meio E3 (que será utilizado como meio de incubação dos embriões). Os embriões devem passar pelo procedimento de bleaching com idade entre 10 e 28 hpf. Após 28 hpf o cório começa a ser degradado por enzimas que preparam o embrião para a eclosão, por isso, essa membrana protetora já está permeável ao cloro. A penetração de cloro pelo cório mata o embrião. É importante salientar que o processo de bleaching, quando realizado entre 10 e 28 hpf, atrapalha a eclosão, tornando o cório mais rígido. Por isso, 30 mg/ml de pronase deve ser utilizada para facilitar a eclosão. Após o processo de bleaching os embriões já podem ser encubados à temperatura de 28,5 °C. Se no outro dia após a realização do processo de bleaching os embriões não tiverem eclodido, a eclosão deve ser realizada manualmente através da retirada do cório com ajuda de uma pinça.

Uma alternativa ao uso de soluções contendo cloro é o bleaching com PVPI como princípio ativo (7474 Chang CT, Amack JD, Whipps CM. Zebrafish Embryo Disinfection with Povidone-Iodine: Evaluating an Alternative to Chlorine Bleach. Zebrafish. 2016;13(S1):S-96-S-101. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1229.
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). Nesse protocolo, 4 banhos são preparados na seguinte sequência: banho de PVPI tamponado na concentração de 12,5 ou 25 ppm e 3 banhos de água Milli-Q estéril. Os embriões são transferidos através dos banhos em peneira, conforme já exposto anteriormente e permanecem no banho de PVPI por 2 minutos, as passagens em água, por sua vez, são banhos rápidos de cerca de 5 segundos. Antes e depois dos banhos descritos, os embriões são mantidos em meio de cultivo de embriões e esse protocolo não requer o uso da pronase. O bleaching é uma importante barreira sanitária na criação de zebrafish, podendo ser usada não só como requisito para o envio de ovos de fornecedores externos, mas também para realizar a desinfecção externa de qualquer desova obtida em um biotério aquático. Além da responsabilidade técnica e da prática de bleaching, animais adquiridos de fornecedores externos devem possuir atestado sanitário sobre o seu estado ou condições de saúde (2222 WHO, World Health Organization. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Good laboratory practice training manual for the trainee: A tool for training and promoting good laboratory practice (GLP) concepts in disease endemic countries. 2nd ed. World Health Organization; 2008. 268p.). No Brasil, a emissão desse tipo de atestado é atividade privativa do profissional médico veterinário (7777 CFMV, Conselho Federal de Medicina Veterinária. Resolução nº 1321, de 27 de abril de 2020. Institui normas sobre os documentos no âmbito da clínica médico-veterinária e dá outras providências. Diário Oficial da União. 2020; nº 79, seção 1, p. 112. Portuguese.).

Em vista disso, uma criação saudável depende também de fornecedores idôneos e comprometidos com a saúde e bem-estar de seus animais. O conhecimento tanto sobre a origem dos peixes quanto sobre sua vida até o momento da chegada ao laboratório é extremamente relevante. Alguns fatores durante a criação, podem influenciar os peixes para toda a vida e justificam a busca de fornecedores idôneos e com a história prévia dos peixes bem controlada. A manutenção do zebrafish em instalações onde os peixes possam visualizar possíveis predadores, tem forte impacto em seu comportamento e sua reatividade para toda a vida (7878 Oliveira TA, Idalencio R, Kalichak F, Rosa JGS, Koakoski G, Abreu MS, Giacomini ACV, Gusso D, Rosemberg DB, Barreto RE, Barcellos LJG. Stress responses to conspecific visual cues of predation risk in zebrafish. PeerJ. 2017;5:e3739. https://doi.org/10.7717/peerj.3739.
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,7979 Abreu MS, Oliveira TA, Koakoski G, Barreto RE, Barcellos LJG. Modulation of Cortisol Responses to an Acute Stressor in Zebrafish Visually Exposed to Heterospecific Fish During Development. Zebrafish. 2018;15(3):228-233. http://doi.org/10.1089/zeb.2017.1509.
http://doi.org/10.1089/zeb.2017.1509...
). Da mesma forma, o tipo de instalações, a forma de manutenção dos peixes (sexos misturados ou separados) e de eventuais enriquecimentos ambientais também podem impactar no comportamento e na reatividade à estímulos dos animais (8080 Reolon GK, Melo GM, Rosa JG, Barcellos LJG, Bonan CD. Sex and the housing: Effects on behavior, cortisol levels and weight in zebrafish. Behavioural Brain Research. 2018;336:85-92. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2017.08.006.
https://doi.org/10.1016/j.bbr.2017.08.00...

81 Rambo CL, Mocelin R, Marcon M, Villanova D, Koakoski G, Abreu MS, Oliveira TA, Barcellos LJG, Piato AL, Bonan CD. Gender differences in aggression and cortisol levels in zebrafish subjected to unpredictable chronic stress. Physiology & Behavior. 2017;171:50-54 https://doi.org/10.1016/j.physbeh.2016.12.032.
https://doi.org/10.1016/j.physbeh.2016.1...
-8282 Soares SM, Kirsten K, Pompermaier A, Maffi VC, Koakoski G, Woloszyn M, Barreto RE, Barcellos LJG. Sex segregation affects exploratory and social behaviors of zebrafish according to controlled housing conditions. Physiology & Behavior.2020;222,112944. https://doi.org/10.1016/j.physbeh.2020.112944.
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). Ainda, mesmo que os peixes sejam criados em água de alta qualidade, livre de contaminantes, se seus pais (geração parental) sofreram alguma contaminação com resíduos de medicamentos ou agrotóxicos, os efeitos podem passar para a próxima geração (4848 Kalichak F, Barcellos HHA, Idalencio R, Koakoski G, Soares SM, Pompermaier A, Rossini M, Barcellos LJG. Persistent and transgenerational effects of risperidone in zebrafish. Environmental Science and Pollution Research. 2019;26:26293-26303. https://doi.org/10.1007/s11356-019-05890-9.
https://doi.org/10.1007/s11356-019-05890...
,8383 Pompermaier A, Tamagno WA, Alves C, Barcellos LJG. Persistent and transgenerational effects of pesticide residues in zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology & Pharmacology. 2022;262:109461. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2022.109461.
https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2022.1094...
).

4.8 Transporte

De acordo com Aleström et al. (4747 Aleström P, D’Angelo L, Midtlyng PJ, Schorderet DF, Schulte-Merker S, Sohm F, Warner S. Zebrafish: Housing and Husbandry Recommendations. Laboratory Animals. 2020;54(3):213-24. https://doi.org/10.1177/0023677219869037.
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) a troca de peixes entre laboratórios apresenta três principais desafios: (1) organizar o envio seguro de peixes, (2) garantir o atendimento ao bem-estar dos peixes, bem como às legislações nacionais e internacionais e, finalmente, (3) evitar a propagação de patógenos entre laboratórios.

Durante o transporte, o desafio é manter a temperatura e os parâmetros de qualidade da água dentro das exigências de zebrafish, em particular no que diz respeito ao oxigênio dissolvido, dióxido de carbono e nitrogênio. O tempo de envio deve ser o mais curto possível, e geralmente é mais fácil enviar e receber embriões do que peixes adultos. Os embriões preparados para embarque devem ser desinfetados por bleaching antes do embarque. O transporte de peixes adultos requer uma densidade relativamente baixa de peixes (dois peixes adultos/0,5 L) e uma proporção de 1:3 ou superior de volume de ar ou oxigênio para água em cada recipiente (8484 Varga ZM. Aquaculture, husbandry, and shipping at the Zebrafish International Resource Center. Methods Cell Biol. 2016;135:509-534. https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2016.01.007.
https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2016.01.0...
). Peixes juvenis e adultos devem ser mantidos em jejum por 24 horas antes da embalagem para reduzir excreção e evitar a degradação da água do recipiente (4747 Aleström P, D’Angelo L, Midtlyng PJ, Schorderet DF, Schulte-Merker S, Sohm F, Warner S. Zebrafish: Housing and Husbandry Recommendations. Laboratory Animals. 2020;54(3):213-24. https://doi.org/10.1177/0023677219869037.
https://doi.org/10.1177/0023677219869037...
). Para tempos de transporte superiores a um dia, recomenda-se adicionar quelantes de amônia à água de transporte, visando reduzir os riscos para a saúde dos peixes. Ao chegar no destino final, os animais devem ser inspecionados quanto ao número, sexo, estado geral de saúde e estresse.

4.9 Quarentena

Após a recepção segura de embriões ou peixes, o próximo desafio é evitar a propagação de patógenos no plantel do laboratório. A desinfecção de ovos por bleaching, apesar de altamente recomendada para uma inserção segura de novas linhagens em um biotério, é ineficiente para eliminação de patógenos intracelulares, como P. neurophilia, por exemplo (4747 Aleström P, D’Angelo L, Midtlyng PJ, Schorderet DF, Schulte-Merker S, Sohm F, Warner S. Zebrafish: Housing and Husbandry Recommendations. Laboratory Animals. 2020;54(3):213-24. https://doi.org/10.1177/0023677219869037.
https://doi.org/10.1177/0023677219869037...
). Peixes recém-chegados podem trazer organismos patogênicos com eles, mesmo que inicialmente os hospedeiros apresentem quadros subclínicos. Nesse caso, o estresse de manuseio e aglomeração durante o transporte, podem causar uma depressão da imunidade do peixe levando à ocorrência de um surto de doença. Uma abordagem combinada para aclimatação e quarentena devem ser utilizados, na medida do possível, para que ambos sejam realizados simultaneamente. Novos estoques devem passar por triagem geral de saúde, sendo que os protocolos de avaliação da saúde utilizados podem ser influenciados pelos objetivos da pesquisa (3333 Barrionuevo WR, Burggren WW. O2 consumption and heart rate in developing zebrafish (Danio rerio): Influence of temperature and ambient O2. American of Journal of Physiology. 1999;276(2):R505-513. https://doi.org/10.1152/ajpregu.1999.276.2.R505.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1999.276...
). É fortemente recomendado manter os animais recém-importados em quarentena para limitar o risco de disseminação de patógenos na instalação principal (4747 Aleström P, D’Angelo L, Midtlyng PJ, Schorderet DF, Schulte-Merker S, Sohm F, Warner S. Zebrafish: Housing and Husbandry Recommendations. Laboratory Animals. 2020;54(3):213-24. https://doi.org/10.1177/0023677219869037.
https://doi.org/10.1177/0023677219869037...
) e, de acordo com Mattews et al. (1515 Matthews M, Trevarrow B, Matthews J. A virtual tour of the Guide for zebrafish users. Lab Animal. 2002;31(3):34-40.), uma vez introduzidos em seu novo tanque, os peixes em quarentena devem permanecer no mesmo por três a quatro semanas. Para laboratórios com apenas alguns tanques em que são empregados menores níveis de biossegurança os animais são mantidos em observação na quarentena durante um período esperando a constatação de sinais clínicos ou mortalidade. Nesse caso é apropriado dedicar um tanque com circulação de água própria como unidade de quarentena, para reduzir o risco de disseminação de patógenos durante a introdução de novos indivíduos. A unidade de quarentena deve ser mantida o mais separado possível de outras unidades, de preferência em uma sala diferente da criação principal. Todos os equipamentos utilizados devem ser de uso exclusivo da unidade de quarentena, recomenda-se que sejam claramente identificados e que nunca entrem em contato com fômites usados na instalação principal.

Já biotérios mais exigentes quanto à biossegurança aplicam quarentenas entre 3 a 4 semanas (8585 Barton, CL, Johnson EW, Tanguay RL. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13;(S1):S-39-S-43. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1232.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1232...
,8686 Collymore C, Crim MJ, Lieggi C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 2016;13(S1):S138-S148. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210...
) e, além disso, realizam alguns testes por amostragem nos animais recebidos, como análises moleculares, histológicas, bacteriológicas e de fezes, por exemplo (8787 Murray KN, Clark TS, Kebus MJ, Kent ML. Specific Pathogen Free - A Review of Strategies in Agriculture, Aquaculture, and Laboratory Mammals and How They Inform New Recommendations for Laboratory Zebrafish. Research in Veterinary Science. 2022;142:78-93. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2021.11.005.
https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2021.11.0...
). No entanto, talvez a recomendação mais importante para entrada de novos animais no biotério seja não integrar novos animais exógenos a experimentos ou à criação principal. Uma alternativa mais segura é criar e reproduzir esses novos animais em quarentena/isolamento e integrar apenas a prole desses animais (7676 Borges AC, Pereira N, Franco M, Vale L, Pereira M, Cunha MV, Amaro A, Albuquerque T, Rebelo M. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 2016;13(S1):1-12. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230...
,8484 Varga ZM. Aquaculture, husbandry, and shipping at the Zebrafish International Resource Center. Methods Cell Biol. 2016;135:509-534. https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2016.01.007.
https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2016.01.0...
,8888 Kent ML, Sanders JL. Important Parasites of Zebrafish in Research Facilities. In: Cartner SC, Eisen JS, Farmer SC, Guillemin KJ, Kent ML, Sanders GE. The Zebrafish in Biomedical Research - Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications [Internet]. 1st ed. London: Elsevier Academic Press; 2020. p. 479-94. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-812431-4.00040-3.
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-8124...
,8989 Silveira T, Kütter MT, Martins CMG, Marins LF, Boyle RT, Campos VF, Remião MH. First record of Clinostomum sp. (Digenea: Clinostomidae) in Danio rerio (Actinopterygii: Cyprinidae) and the implication of using zebrafish from pet stores on research. Zebrafish. 2021;18(2):139-148. https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950.
https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950...
), ou mesmo a prole da prole (geração F2) (8484 Varga ZM. Aquaculture, husbandry, and shipping at the Zebrafish International Resource Center. Methods Cell Biol. 2016;135:509-534. https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2016.01.007.
https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2016.01.0...
) após constatado o estado sanitário satisfatório dos peixes.

4.10 Monitoramento sanitário dos animais

Outra recomendação para avaliar a saúde da colônia criada em um biotério aquático é a prática, já tradicional em biotérios de roedores, de criação e manutenção de sentinelas (9090 Mähler M, Berard M, Feinstein R, Gallagher A, Illgen-Wilcke B, Pritchett-Corning K, Raspa M. FELASA Recommendations for the Health Monitoring of Mouse, Rat, Hamster, Guinea Pig and Rabbit Colonies in Breeding and Experimental Units. Laboratory Animals. 2014;48(3):178-192. https://doi.org/10.1177/0023677213516312.
https://doi.org/10.1177/0023677213516312...
). Animais sentinelas são indivíduos indicadores do estado sanitário da colônia inteira. Em biotérios de zebrafish, os sentinelas são mantidos de forma que as principais fontes de riscos à saúde da colônia sejam apresentadas a eles de maneira mais intensificada para que sejam avaliados frequentemente sem a necessidade de se desfazer de animais da colônia principal. Geralmente zebrafish sentinelas são expostos em aquários isolados ao efluente do sistema de criação inteiro com as trocas parciais de água que permitam o bem-estar ideal, mas sempre usando o efluente como meio de criação (8585 Barton, CL, Johnson EW, Tanguay RL. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13;(S1):S-39-S-43. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1232.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1232...
,8686 Collymore C, Crim MJ, Lieggi C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 2016;13(S1):S138-S148. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210...
). Idealmente, os indivíduos devem ser selecionados como sentinelas já a partir da eclosão. Isso reduz o risco de estarem indicando problemas externos ao biotério, no caso de animais exógenos e introduzidos em estágios posteriores. O período mínimo de manutenção desses animais é de 3 meses (8686 Collymore C, Crim MJ, Lieggi C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 2016;13(S1):S138-S148. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210...
,9191 Kent ML, Feist SW, Harper C, Hoogstraten-Miller S, Law JM, Sánchez-Morgado JM, Tanguay RL, Sanders GE, Spitsbergen JM, Whipps CM. Recommendations for Control of Pathogens and Infectious Diseases in Fish Research Facilities. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacology. 2009;149(2):240-48. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2008.08.001.
https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2008.08.0...
). Porém, animais mais velhos podem ser mantidos para que indiquem também afecções que possam estar relacionadas à idade ou a problemas originados de exposições crônicas. Os sentinelas já têm o destino traçado desde a eclosão e esse destino não deve ser desviado. Sendo assim, recomenda-se que os sentinelas não sejam usados com finalidades alheias à detecção de problemas de saúde e bem-estar no ambiente do biotério, como para reprodução ou para experimentação, por exemplo.

Por outro lado, há autores que defendem que, para algumas doenças, o melhor método para detecção de um agente etiológico que está causando um quadro subclínico é a testagem por amostragem representativa ao invés de usar animais sentinelas ou animais resgatados do sump de sistemas de recirculação, por exemplo. Outra promissora fonte de material a ser usado para vigilância sanitária da colônia são os indivíduos moribundos ou recém mortos (9292 Marancik D, Collins J, Afema J, Lawrence C. Exploring the Advantages and Limitations of Sampling Methods Commonly Used in Research Facilities for Zebrafish Health Inspections. Laboratory Animals. 2020;54(4):373-385. https://doi.org/10.1177/0023677219864616.
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). O monitoramento sanitário periódico não requer obrigatoriamente que sinais clínicos sejam observados, porém, é imprescindível que o bioterista monitore as características gerais dos animais da colônia para perceber quando alguma anormalidade se instalar sobre a criação.

Além do aspecto sanitário comentado acima, justifica-se a vital importância estabelecer uma rotina de monitoramento e recolhimento de peixes moribundos e mortos, pelo fato de que odores liberados de peixes mortos podem causar respostas comportamentais nos peixes vivos desse aquário. De fato, os odores provenientes dos zebrafish mortos induzem comportamento defensivo nos vivos. Essas respostas coincidem com a destruição das células epidérmicas, indicando que as respostas defensivas e de estresse podem ocorrer como um efeito de substâncias que emanam da carne em decomposição, bem como substância de alarme liberada devido à ruptura das células epidérmicas. Assim, caso o monitoramento e o recolhimento dos peixes mortos não sejam padronizados, pode haver alterações comportamentais que irão enviesar experimentos com esses animais (9393 Oliveira TA, Koakoski G, Motta AC, Piato AL, Barreto RE, Volpato GL, Barcellos LJG. Death-associated odors induce stress in zebrafish. Hormones and Behavior. 2014;65(4):340-344. https://doi.org/10.1016/j.yhbeh.2014.02.009.
https://doi.org/10.1016/j.yhbeh.2014.02....
).

4.11 Características biológicas normais de zebrafish mantidos em biotério

Para identificar sinais de estresse, sinais clínicos e anormalidades anatômicas e de comportamento é de fundamental importância que o bioterista conheça os animais mantidos na colônia. Zebrafish adultos preferem nadar em cardume, são bastante curiosos e exploram todo o aquário (9494 Paciorek T, Mcrobert S. Daily Variation in the Shoaling Behavior of Zebrafish Danio rerio. Current zoology. 2012;58(1):129-137. https://doi.org/10.1093/czoolo/58.1.129.
https://doi.org/10.1093/czoolo/58.1.129...
). A espécie é altamente social e apresenta o comportamento de “shoaling”, que é a simples agregação de vários animais em uma mesma área. A espécie ainda apresenta o comportamento de “schooling”, que é o nado sincronizado e com movimentos coordenados, no entanto não está claro se esse comportamento é normal ou decorrente de excitação (9595 Graham C, von Keyserlingk MAG, Franks B. Zebrafish Welfare: Natural History, Social Motivation and Behaviour. Applied Animal Behaviour Science. 2018;200:13-22. https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017.11.005.
https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017....
). Quando transferidos para um novo aquário, os animais logo ocupam o fundo e aos poucos passam a explorar os níveis superiores da coluna d’água.

Hierarquias bem definidas se formam no grupo e espaço (tanque), além disso, outros recursos podem ser disputados e defendidos gerando agressão e ferimentos (9595 Graham C, von Keyserlingk MAG, Franks B. Zebrafish Welfare: Natural History, Social Motivation and Behaviour. Applied Animal Behaviour Science. 2018;200:13-22. https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017.11.005.
https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017....

96 Colwill RM, Creton R. Imaging Escape and Avoidance Behavior in Zebrafish Larvae. Reviews in the Neurosciences. 2011;22(1):63-73. https://doi.org/10.1515/RNS.2011.008.
https://doi.org/10.1515/RNS.2011.008...
-9797 Ali M K, Nicholson HL. Increasing Zebrafish (Danio rerio) Numbers in a Limited Tank Space Reduces Night-Time Fish Sleep-like State and and Induces Aggressive Behaviour. World Journal of Depression and Anxiety. 2018;1(1):1003.). Grupos de machos e fêmeas preferem ambientes com plantas flutuantes a ambientes estéreis, apesar de as fêmeas também mostrarem preferência por plantas submersas (9595 Graham C, von Keyserlingk MAG, Franks B. Zebrafish Welfare: Natural History, Social Motivation and Behaviour. Applied Animal Behaviour Science. 2018;200:13-22. https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017.11.005.
https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017....
). Zebrafish possuem escototaxia, ou seja, preferem ambientes escuros àqueles muito iluminados. Além disso, apresentam tigmotaxia, ou seja, preferem nadar próximos a paredes como as paredes do aquário, por exemplo. Na natureza esses comportamentos são essenciais para evitar predadores. No entanto, quando os animais já estão aclimatados ao ambiente de criação o cardume explora toda a coluna d’água. Além disso, zebrafish possuem células chamadas melanóforos, contendo grânulos do pigmento melanina, os melanossomos. Dependendo da condição ambiental os zebrafish podem mudar de cor. Esse fenômeno também auxilia na fuga de predadores. Quando em ambiente estressante, os melanossomos se agregam e a coloração dos peixes fica mais clara e sem brilho. Quando em ambiente tranquilo, os melanossomos se dispersam e os animais ficam com coloração mais viva e brilhante (9696 Colwill RM, Creton R. Imaging Escape and Avoidance Behavior in Zebrafish Larvae. Reviews in the Neurosciences. 2011;22(1):63-73. https://doi.org/10.1515/RNS.2011.008.
https://doi.org/10.1515/RNS.2011.008...
). Por isso, a cor pode ser usada como um indicador em tempo real de estresse, medo ou ansiedade. Apesar de geralmente a coloração dos machos ser mais brilhante e mais dourada e a das fêmeas ser menos brilhante e mais prateada, isso não é uma regra para todos os animais e as diferenças entre machos e fêmeas são maiores durante a manhã. Ou seja, a coloração dos animais muda ao longo do dia. Além disso, em testes cegos, machos mais coloridos apresentam comportamento reprodutivo mais intenso (9898 Hutter S, Hettyey A, Penn DJ, Zala SM. Ephemeral Sexual Dichromatism in Zebrafish (Danio rerio). Ethology. 2012;118(12):1208-1218. https://doi.org/10.1111/eth.12027.
https://doi.org/10.1111/eth.12027...
). Por isso, o conhecimento do padrão de coloração também pode ser usado para inferir a saúde reprodutiva de alguns animais.

Muitos biotérios ao redor do mundo optam por aquários sem enriquecimento ambiental em favor da higiene no sistema de manutenção dos peixes. Cascalho no fundo e “plantas de plástico”, mesmo que artificiais, podem facilitar a acumulação de matéria orgânica na água, o que dificulta a limpeza dos aquários. Essa preferência por ambientes estéreis interfere no bem-estar da criação, visto que é bem documentado que o zebrafish têm preferência por ambientes enriquecidos (9595 Graham C, von Keyserlingk MAG, Franks B. Zebrafish Welfare: Natural History, Social Motivation and Behaviour. Applied Animal Behaviour Science. 2018;200:13-22. https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017.11.005.
https://doi.org/10.1016/j.applanim.2017....
,9999 Lidster K, Readman GD, Prescott MJ, Owen SF. International Survey on the Use and Welfare of Zebrafish Danio rerio in Research. Journal of Fish Biology. 2017;90(5):1891-1905. https://doi.org/10.1111/jfb.13278.
https://doi.org/10.1111/jfb.13278...
,100100 Stevens CH, Reed BT, Hawkins P. Enrichment for Laboratory Zebrafish - A Review of the Evidence and the Challenges. Animals. 2021;11(3):698. https://doi.org/10.3390/ani11030698.
https://doi.org/10.3390/ani11030698...
). Uma alterativa para melhorar o bem-estar dos animais sem abrir mão da higiene controlada dos aquários é usar imagens impressas de cascalho no fundo do aquário e de plantas nas paredes do aquário (100100 Stevens CH, Reed BT, Hawkins P. Enrichment for Laboratory Zebrafish - A Review of the Evidence and the Challenges. Animals. 2021;11(3):698. https://doi.org/10.3390/ani11030698.
https://doi.org/10.3390/ani11030698...
). Outra opção de enriquecimento ambiental, que tem como vantagem não impactar nas rotinas de limpeza das instalações é o enriquecimento auditivo ou musical que tem se mostrado eficaz para deixas os peixes mais calmos e menos ansiosos, inclusive reduzindo o estresse causado pelo isolamento, comum nos testes comportamentais como o teste do Tanque Novo, por exemplo (101101 Barcellos HHA, Koakoski G, Chaulet F, Kirsten KS, Kreutz LC, Kalueff AV, Barcellos LJG. The effects of auditory enrichment on zebrafish behavior and physiology. PeerJ. 2018;6:e5162. https://doi.org/10.7717/peerj.5162.
https://doi.org/10.7717/peerj.5162...
,102102 Marchetto L, Barcellos LJG, Koakoski K, Soares SM, Pompermaier A, Maffi VC, Costa R, Silva CG, Zorzi NR, Demin KA, Kalueff AV, Barcellos HHA. Auditory environmental enrichment prevents anxiety-like behavior, but not cortisol responses, evoked by 24-h social isolation in zebrafish, Behavioural Brain Research. 2021;404:113169. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2021.113169.
https://doi.org/10.1016/j.bbr.2021.11316...
).

As características apresentadas são uma generalização para a espécie. Porém, é importante salientar que existem variações e particularidades individuais de cada espécime de uma colônia. Em vista do exposto, recomenda-se que o bioterista conheça os animais sob sua supervisão e saiba identificar as principais variações anatômicas e comportamentais a nível de grupo e de indivíduo. Isso possibilitará que o bioterista seja capaz de proceder o diagnóstico de cenários patológicos, ou não, e a tomada de decisão em direção da solução das intercorrências impostas pela rotina da criação no biotério.

4.12 Doenças e sinais clínicos de zebrafish mantidos em biotério

A suscetibilidade de zebrafish a vários agentes etiológicos está amplamente documentada (Tabela 2). Esses agentes são capazes de desencadear alterações morfológicas, fisiológicas e comportamentais, fazendo com que os padrões normais descritos anteriormente sejam leve ou intensamente desestabilizados. Dentre os principais sinais clínicos associados a doenças em zebrafish estão: nado anormal; emaciação; protusão de escamas dorsais; distensão da cavidade celomática; congestão e hemorragias de pele; dispneia; nadadeiras rentes ao corpo; curvatura espinhal; prolapso retal; nado na superfície; nado no fundo; isolamento; inapetência; perda de peso/score corporal; úlceras externas; mortalidade em grupo (7676 Borges AC, Pereira N, Franco M, Vale L, Pereira M, Cunha MV, Amaro A, Albuquerque T, Rebelo M. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 2016;13(S1):1-12. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230...
,8686 Collymore C, Crim MJ, Lieggi C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 2016;13(S1):S138-S148. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1210...
,8989 Silveira T, Kütter MT, Martins CMG, Marins LF, Boyle RT, Campos VF, Remião MH. First record of Clinostomum sp. (Digenea: Clinostomidae) in Danio rerio (Actinopterygii: Cyprinidae) and the implication of using zebrafish from pet stores on research. Zebrafish. 2021;18(2):139-148. https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950.
https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950...
). Das doenças infecciosas, as mais prevalentes em biotérios de zebrafish parecem ser causadas por P. neurophilia e Mycobacterium spp. (7676 Borges AC, Pereira N, Franco M, Vale L, Pereira M, Cunha MV, Amaro A, Albuquerque T, Rebelo M. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 2016;13(S1):1-12. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230.
https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1230...
). Para o bioterista conhecer mais profundamente as doenças de zebrafish recomenda-se os estudos de Esmail et al. (103103 Esmail MY, Astrofsky KM, Lawrence C, Serluca FC. The Biology and Management of the Zebrafish. In: Fox JG, Anderson LC, Otto GM, Pritchett-Corning KR, Whary MT. Laboratory Animal Medicine. 3rd ed. London: Academic Press - Elsevier Inc.; 2015. p.1015-1062. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409527-4.00020-1.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409527...
); Kent e Sanders (8888 Kent ML, Sanders JL. Important Parasites of Zebrafish in Research Facilities. In: Cartner SC, Eisen JS, Farmer SC, Guillemin KJ, Kent ML, Sanders GE. The Zebrafish in Biomedical Research - Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications [Internet]. 1st ed. London: Elsevier Academic Press; 2020. p. 479-94. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-812431-4.00040-3.
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-8124...
) e Kent et al. (104104 Kent ML, Sanders JL, Spagnoli S, Al-Samarrie CE, Murray KN. Review of Diseases and Health Management in Zebrafish Danio rerio (Hamilton 1822) in Research Facilities. Journal of Fish Diseases. 2020;43(6):637-650. https://doi.org/10.1111/jfd.13165.
https://doi.org/10.1111/jfd.13165...
).

Tabela 2
Principais patógenos identificados em zebrafish (Danio rerio) e informações sobre órgãos acometidos, sinais clínicos e riscos à saúde humana.

Ao analisar a Tabela 2 é possível perceber que muitas dessas afecções apresentam possíveis sinais clínicos em comum, mesmo as causadas por agentes etiológicos muito distintos (como, por exemplo, infecções causadas por Mycobacterium marinum e Pseudocapillaria tomentosa) e várias possuem latência de vários meses ou se apresentam de forma subclínica (como P. neurophilia; Mycobacterium spp.; Myxidium spp. e P. tomentosa, por exemplo). Por isso, é importante que além da simples observação e exame clínico, o responsável pelos animais utilize também quantos métodos complementares estiverem disponíveis que auxiliem no diagnóstico definitivo (9292 Marancik D, Collins J, Afema J, Lawrence C. Exploring the Advantages and Limitations of Sampling Methods Commonly Used in Research Facilities for Zebrafish Health Inspections. Laboratory Animals. 2020;54(4):373-385. https://doi.org/10.1177/0023677219864616.
https://doi.org/10.1177/0023677219864616...
).

Muitos desses agentes causadores de enfermidades em zebrafish fazem parte da microbiota normal da espécie (103103 Esmail MY, Astrofsky KM, Lawrence C, Serluca FC. The Biology and Management of the Zebrafish. In: Fox JG, Anderson LC, Otto GM, Pritchett-Corning KR, Whary MT. Laboratory Animal Medicine. 3rd ed. London: Academic Press - Elsevier Inc.; 2015. p.1015-1062. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409527-4.00020-1.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409527...
,105105 Cantas L, Sørby JRT, Aleström P, Sørum H. Culturable Gut Microbiota Diversity in Zebrafish. Zebrafish. 2012;9(1):26-37. https://doi.org/10.1089/zeb.2011.0712.
https://doi.org/10.1089/zeb.2011.0712...
) caracterizando-se como agentes oportunistas. Ainda, vários patógenos, inclusive alguns zoonóticos, têm sido usados para modelagem experimental de infecções em zebrafish como, por exemplo, Edwardsiella tarda; Vibrio cholerae; Staphylococcus aureus; Aeromonas salmonicida; Spring viremia of carp virus (SVCV) e diversos outros (106106 Pressley ME, Phelan PE, Witten PE, Mellon MT, Kim CH. Pathogenesis and Inflammatory Response to Edwardsiella tarda Infection in the Zebrafish. Developmental and Comparative Immunology. 2005;29(6):501-513. https://doi.org/10.1016/j.dci.2004.10.007.
https://doi.org/10.1016/j.dci.2004.10.00...

107 Lin B, Chen S, Cao Z, Lin Y, Mo D, Zhang H, Gu J, Dong M, Liu Z, Xu A. Acute Phase Response in Zebrafish upon Aeromonas salmonicida and Staphylococcus aureus Infection: Striking Similarities and Obvious Differences with Mammals. Molecular Immunology. 2007;44(4):295-301. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2006.03.001.
https://doi.org/10.1016/j.molimm.2006.03...

108 Kanther M, Rawls JF. Host-Microbe Interactions in the Developing Zebrafish. Current Opinion in Immunology. 2010;22(1):10-19. https://doi.org/10.1016/j.coi.2010.01.006.
https://doi.org/10.1016/j.coi.2010.01.00...

109 Runft DL, Mitchell KC, Abuaita BH, Allen JP, Bajer S, Ginsburg K, Neely MN, Withey JH. Zebrafish as a Natural Host Model for Vibrio cholerae Colonization and Transmission. Applied and Environmental Microbiology. 2014;80(5):1710-1717. https://doi.org/10.1128/AEM.03580-13.
https://doi.org/10.1128/AEM.03580-13...

110 Mitchell, KC, Breen P, Britton S, Neely MN, Withey JH. Quantifying Vibrio cholerae Enterotoxicity in a Zebrafish Infection Model. Applied and Environmental Microbiology. 2017;83(16):e00783-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00783-17.
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-111111 Rongrong L, Hu X, Lü A, Song Y, Lian Z, Sun J, Sung YY. Proteomic Profiling of Zebrafish Challenged by Spring Viremia of Carp Virus Provides Insight into Skin Antiviral Response. Zebrafish. 2020;17(2):91-103. https://doi.org/10.1089/zeb.2019.1843.
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). Por isso, ratifica-se a manutenção das boas práticas no biotério relacionadas a fatores como qualidade da água, barreiras sanitárias e ao bem-estar para que surtos de doenças críticas para a colônia ou para os manipuladores não se instalem em decorrência da debilidade imunológica dos animais provocada pelo desbalanço desses fatores.

Além dessas doenças infecciosas, diversas doenças podem se desenvolver nos zebrafish a partir da manutenção da criação sob parâmetros ambientais desfavoráveis, são as chamadas doenças ambientais. Dentre elas, podem ser citadas as lesões branquiais decorrentes por exposição à amônia, nitritos, nitratos e ao cloro; a nefrocalcinose, decorrente da apresentação em excesso de cálcio ambiental/nutricional e do excesso de dióxido de carbono (CO2) na água; a doença das bolhas de gás, decorrente da supersaturação de oxigênio na água; os tumores ultimobranquiais, provavelmente decorrentes do desbalanço eletrolítico do meio; os tumores de tireoide, causados pela deficiência de iodo; e finalmente a megalocitose hepática e os seminomas, causados possivelmente pela exposição a xenobióticos e carcinógenos, respectivamente (104104 Kent ML, Sanders JL, Spagnoli S, Al-Samarrie CE, Murray KN. Review of Diseases and Health Management in Zebrafish Danio rerio (Hamilton 1822) in Research Facilities. Journal of Fish Diseases. 2020;43(6):637-650. https://doi.org/10.1111/jfd.13165.
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). A partir dessa série de doenças salienta-se a importância da manutenção de um meio de cultivo saudável e do controle e correção dos parâmetros de qualidade da água como práticas favoráveis à saúde plena da criação.

Ainda, existem doenças idiopáticas, ou seja, com causa desconhecida como, por exemplo, deformações espinhais; inflamação associada ao ovo; malformações operculares; lesões proliferativas de ducto biliar e pancreático; cordoma; tumores de bainha de nervo periférico e linfossarcoma (104104 Kent ML, Sanders JL, Spagnoli S, Al-Samarrie CE, Murray KN. Review of Diseases and Health Management in Zebrafish Danio rerio (Hamilton 1822) in Research Facilities. Journal of Fish Diseases. 2020;43(6):637-650. https://doi.org/10.1111/jfd.13165.
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). Devido ao desconhecimento da origem dessas afecções, recomenda-se evitar variações bruscas da qualidade da água ou do manejo geral, de forma que os animais não entrem em um quadro de stress ou baixa imunológica que possa desengatilhar tais doenças.

Várias das doenças apresentadas na Tabela 2 estão relacionadas com a idade dos animais. Até os 24 meses de idade a prevalência de patógenos e de lesões associadas em geral aumenta conforme a idade dos animais (7575 CFMV, Conselho Federal de Medicina Veterinária. 2017. Resolução no 1165, de 11 de agosto de 2017. Dispõe sobre Anotação de Responsabilidade Técnica e registro de profissionais e de estabelecimentos de cultivo e manutenção de organismos aquáticos. Diário Oficial da União. 2017; seção 1, p. 65. Portuguese.). Por isso, não é recomendado manter animais idosos no plantel principal. Quando os procedimentos experimentais exigirem animais em senescência, estes devem ser isolados dos demais, de forma a reduzir o risco de transmissão de doenças relacionadas à idade.

Assim, a simples percepção de anormalidades individuais ou coletivas dos peixes, pode indicar ao bioterista que a colônia está sendo acometida por algo e, também, pode nortear a tomada de decisão rumo à solução do problema. Nos casos em que o pesquisador perceba qualquer sinal clínico e desvio de comportamento, a recomendação mais adequada é separar os peixes acometidos dos demais o mais rápido possível para depois planejar a melhor abordagem para o problema. Dessa forma interrompe-se a transmissão do agente para animais sadios, em casos de doenças infecciosas cujo ciclo ainda esteja no início. Em casos de agressão entre companheiros do mesmo aquário, o animal agressor deve ser isolado dos demais para que a hierarquia seja quebrada e esse animal perca sua dominância sobre os outros em uma possível volta ao mesmo aquário. Uma substância de alerta é liberada na água quando um peixe está machucado sinalizando a todos os peixes que compartilham o ambiente que existe alguma ameaça iminente (9696 Colwill RM, Creton R. Imaging Escape and Avoidance Behavior in Zebrafish Larvae. Reviews in the Neurosciences. 2011;22(1):63-73. https://doi.org/10.1515/RNS.2011.008.
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). Por isso, se o peixe agredido estiver muito lesionado, ele também pode ser isolado em um tanque hospital para tratamento ou para repouso antes que seja direcionado de volta ao aquário, visando diminuir o estresse do próprio animal e dos companheiros de aquário. Vale salientar que zebrafish é uma espécie social e que o isolamento por longos períodos pode gerar estresse nos animais (4646 Timmons MB, Ebeling JM, Wheaton JM, Summerelt ST, Vinci BJ. Recirculating Aquaculture Systems. 2nd ed. Ithaca (NY): Cayuga Aqua Ventures; 2002. 757p.).

4.13 Controle da Microbiota

Para evitar problemas sanitários com vários dos patógenos citados, os biotérios aquáticos de zebrafish podem adotar a criação de colônias “specific pathogen free” (SPF, livres de patógenos específicos) ou mesmo “germ free” (livres de germes, totalmente livres de microbiota). Biotérios com criações desse tipo sem dúvidas são aqueles que mais atentam para o estado de saúde geral e específica de seus animais e, por isso, requerem maior investimento em instalações, materiais, rações, barreiras sanitárias, pessoal, procedimentos e, principalmente, testagem e diagnóstico definitivo (8787 Murray KN, Clark TS, Kebus MJ, Kent ML. Specific Pathogen Free - A Review of Strategies in Agriculture, Aquaculture, and Laboratory Mammals and How They Inform New Recommendations for Laboratory Zebrafish. Research in Veterinary Science. 2022;142:78-93. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2021.11.005.
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,9292 Marancik D, Collins J, Afema J, Lawrence C. Exploring the Advantages and Limitations of Sampling Methods Commonly Used in Research Facilities for Zebrafish Health Inspections. Laboratory Animals. 2020;54(4):373-385. https://doi.org/10.1177/0023677219864616.
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). Por exemplo, colônias SPF regularmente adotam um criterioso monitoramento periódico do status sanitário. Além disso, optam por não utilizar alimento vivo, visto que a manutenção das espécies de invertebrados com microbiota controlada torna-se um desafio maior do que a própria criação de zebrafish (8585 Barton, CL, Johnson EW, Tanguay RL. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13;(S1):S-39-S-43. https://doi.org/10.1089/zeb.2015.1232.
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).

No entanto, por mais que a eliminação completa ou parcial de microrganismos associados pareça uma vantagem para a criação de qualquer animal, efeitos adversos também existem. O status sanitário dos animais é citado como uma variável capaz de afetar o sistema imune e a resposta ao tratamento experimental em animais de laboratório (112112 Beura, LK, Hamilton SE, Bi K, Schenkel JM, Odumade OA, Casey KA, Thompson EA, Fraser KA, Rosato PC, Filali-Mouhim A, Sekaly RP, Jenkins MK, Vezys V, Haining WN, Jameson SC, Masopust D. Normalizing the Environment Recapitulates Adult Human Immune Traits in Laboratory Mice. Nature. 2016;532(7600):512-516. https://doi.org/10.1038/nature17655.
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,113113 Rosshart SP, Vassallo BG, Angeletti D, Hutchinson DS, Morgan AP, Takeda K, Hickman HD, McCulloch JA, Badger JH, Ajami NJ, Trinchieri G, Villena FP-M, Yewdell JW, Rehermann B. Wild Mouse Gut Microbiota Promotes Host Fitness and Improves Disease Resistance. Cell. 2017;171(5):1015-1028.e13. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.09.016.
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). Da mesma forma que a presença de organismos patogênicos é capaz de afetar a fisiologia geral e o desenvolvimento dos animais, a total ausência também é capaz disso (114114 Kanther M, Sun X, Mühlbauer M, MacKey LC, Flynn III EJ, Bagnat M, Jobin C, Rawls JF. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-KB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 2011;141(1):197-207. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.03.042.
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). Zebrafish germ free apresentam ausência de ativação natural de vias importantes para maturação do sistema imune e para homeostase de tecidos diversos (114114 Kanther M, Sun X, Mühlbauer M, MacKey LC, Flynn III EJ, Bagnat M, Jobin C, Rawls JF. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-KB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 2011;141(1):197-207. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.03.042.
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); menor resistência imunológica a agentes infecciosos (115115 Galindo-Villegas J, Garciá-Moreno D, Oliveira S, Meseguer J, Mulero V. Regulation of Immunity and Disease Resistance by Commensal Microbes and Chromatin Modifications during Zebrafish Development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2012;109(39):e2605-e2614. https://doi.org/10.1073/pnas.1209920109.
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); menor proliferação de células epiteliais do intestino (116116 Cheesman SE, Neal JT, Mittge E, Seredick BM, Guillemin K. Epithelial Cell Proliferation in the Developing Zebrafish Intestine Is Regulated by the Wnt Pathway and Microbial Signaling via Myd88. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011;108(1):4570-4577. https://doi.org/10.1073/pnas.1000072107.
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); menor capacidade de absorção de lipídios (117117 Semova I, Carten JD, Stombaugh J, MacKey LC, Knight R, Farber SA, Rawls JF. Microbiota Regulate Intestinal Absorption and Metabolism of Fatty Acids in the Zebrafish Cell Host and Microbe. 2012;12(3):277-288. https://doi.org/10.1016/j.chom.2012.08.003.
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) e possuem comportamento locomotor drasticamente alterado(118118 Davis DJ, Bryda EC, Gillespie CH, Ericsson AC. Microbial Modulation of Behavior and Stress Responses in Zebrafish Larvae. Behavioural Brain Research. 2016;311:219-227. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2016.05.040.
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,119119 Phelps D, Brinkman NE, Keely SP, Anneken EM, Catron TR, Betancourt D, Wood CE, Espenschied ST, Rawls JF, Tal T. Microbial Colonization Is Required for Normal Neurobehavioral Development in Zebrafish. Scientific Reports. 2017;7(1):1-13. https://doi.org/10.1038/s41598-017-10517-5.
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), por exemplo. Por isso, alguns autores afirmam que modelos com microbiota mais natural devem ser preconizados em estudos translacionais e modelos SPF devem ser direcionados a estudos mecanísticos sobre a relação entre microbiota e patogêneses diversas (120120 Dobson GP, Letson HL, Biros E, Morris J. Specific Pathogen-Free (SPF) Animal Status as a Variable in Biomedical Research: Have We Come Full Circle? EbioMedicine. 2019;41:42-43. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.02.038.
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). Dessa forma, os pesquisadores e instituições devem adequar a forma de suas criações, bem como suas barreiras sanitárias e programas de monitoramento, ao objetivo dos estudos desenvolvidos. Da mesma forma, é imprescindível que cada estudo seja planejado tendo em mente a capacidade, estrutura e padrão sanitário do biotério que subsidiará a pesquisa. Para isso, o planejamento conjunto e colaborativo entre pesquisadores e bioteristas é essencial.

4.14 Recomendações sobre saúde única relacionada a biotérios de zebrafish

As recomendações sobre saúde de zebrafish não devem estar limitadas ao âmbito da saúde animal, mas sim da saúde única. O conceito de saúde única foi criado em 2004 e é diretamente derivado do conceito de medicina única, o qual prega a união da medicina humana e medicina veterinária em resposta às zoonoses (121121 Destoumieux-Garzón D, Mavingui P, Boetsch G, Boissier J, Darriet F, Duboz P, Fritsch C, Giraudoux P, Le Roux F, Morand S, Paillard C, Pontier D, Sueur C, Voituron Y. The One Health Concept: 10 Years Old and a Long Road Ahead. Frontiers in Veterinary Science. 2018;5:article 14,1-13. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00014.
https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00014...
,122122 Zinsstag J, Schelling E, Waltner-Toews D, Tanner M. From ‘One Medicine’ to ‘One Health’ and Systemic Approaches to Health and Well-Being. Preventive Veterinary Medicine. 2011;101(3-4):148-56. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2010.07.003.
https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2010...
). Em 2008, a OMS, a Organização Mundial da Saúde Animal (OIE) e a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO) criaram a iniciativa “One World, One Health” (Um mundo, uma saúde), na qual o termo “One Health” (traduzido para o português como saúde única) expressa a indissociabilidade da saúde humana, saúde animal e saúde do ecossistema (ou saúde ambiental) (123123 WHO - World Health Organization, FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations, OIE - World Organisation for Animal Health. Taking a Multisectoral, One Health Approach: A Tripartite Guide to Addressing Zoonotic Diseases in Countries. 2019. p.151.,124124 Couto RM, Brandespim DF. A Review of the One Health Concept and Its Application as a Tool for Policy-Makers. International Journal of One Health. 2020;6(1):83-89. https://doi.org/10.14202/IJOH.2020.83-89.
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). Doenças parasitárias de zebrafish têm relevância para a saúde única (8989 Silveira T, Kütter MT, Martins CMG, Marins LF, Boyle RT, Campos VF, Remião MH. First record of Clinostomum sp. (Digenea: Clinostomidae) in Danio rerio (Actinopterygii: Cyprinidae) and the implication of using zebrafish from pet stores on research. Zebrafish. 2021;18(2):139-148. https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950.
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,125125 Pace A, Dipineto L, Aceto S, Censullo MC, Valoroso MC, Varriale L, Rinaldi L, Menna LF, Fioretti A, Borrelli L. Diagnosis of Centrocestus formosanus Infection in Zebrafish (Danio rerio) in Italy: A Window to a New Globalization-Derived Invasive Microorganism. Animals. 2020;10(3):456. https://doi.org/10.3390/ani10030456.
https://doi.org/10.3390/ani10030456...
). Desse ponto de vista, a saúde de uma colônia de zebrafish pode impactar a saúde dos experimentadores e bioteristas, bem como de pessoas de suas convivências e do meio ambiente e, por isso, algumas recomendações são importantes.

4.14.1 Saúde humana

Vários dos agentes infecciosos já identificados natural ou experimentalmente em zebrafish têm potencial de serem transmissíveis tanto de humanos para zebrafish quanto de zebrafish para humanos (ou seja, são tanto zooantroponóticos quanto antropozoonóticos, respectivamente) como, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia e fungos dos gêneros Aspergillus, Candida e Cryptococcus (126126 Mesureur J, Vergunst AC. Zebrafish Embryos as a Model to Study Bacterial Virulence. In: Vergunst AC, O‘Callaghan D. Host-Bacteria Interactions Methods and Protocols. 1st ed. New York: Humana Press; 2014. p. 41-66. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1261-2.
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1261-...
,127127 Rosowski EE, Knox BP, Archambault LS, Huttenlocher A, Keller NP, Wheeler RT, Davis JM. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 2018;4(4):136. https://doi.org/10.3390/jof4040136.
https://doi.org/10.3390/jof4040136...
). Não à toa zebrafish está sendo usado como modelo de estudo sobre infectologia humana (128128 Gomes MC, Mostowy S. The Case for Modeling Human Infection in Zebrafish. Trends in Microbiology. 2020;28(1):10-18. https://doi.org/10.1016/j.tim.2019.08.005.
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). Por isso, o bioterista deve ter em mente que os animais da colônia podem estar abrigando natural ou experimentalmente algum patógeno humano. No caso de infecções experimentais por esses patógenos, os aquários devem estar devidamente identificados e apenas os profissionais treinados e envolvidos no projeto devem entrar em contato com os aquários e fômites usados. O potencial zoonótico das principais doenças de zebrafish está indicado na Tabela 2.

De fato, os bioteristas que desenvolvem suas atividades com zebrafish estão constantemente expostos a riscos ocupacionais potencialmente importantes. A preocupação se intensifica ainda mais pelo fato de esses agentes infecciosos se apresentarem através da água, que, por sua vez, é uma das principais fontes de disseminação de doenças para humanos (129129 Pandey PK, Kass PH, Soupir ML, Biswas S, Singh VP. Contamination of Water Resources by Pathogenic Bacteria. AMB Express. 2014;4(1):1-16. https://doi.org/10.1186/s13568-014-0051-x.
https://doi.org/10.1186/s13568-014-0051-...
,130130 Leclerc H, Schwartzbrod L, Dei-Cas E. Microbial Agents Associated with Waterborne Diseases. Critical Reviews in Microbiology. 2002;28(4):371-409. https://doi.org/10.1080/1040-840291046768.
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). Em vista disso, recomenda-se que o manipulador sempre higienize as mãos antes e após o contato com os animais, água de criação ou qualquer fômite que tenha entrado em contato com a água do biotério e use luvas para realização dessas atividades. O uso de máscara de proteção também se faz necessário, visto que o ambiente de um biotério aquático pode frequentemente ter formação de gotículas que podem ser inaladas ou ingeridas inadvertidamente. Outra recomendação importante é que, tão logo se perceba animais mortos nos aquários, eles sejam retirados e usados em programas de vigilância (como já abordado) e/ou descartados de forma correta (ver adiante). A higienização e desinfecção de fômites que entraram ou que entrarão em contato com a água de criação, bem como uso de pedilúvio na entrada e na saída, são importantes medidas tanto de biossegurança quanto de biosseguridade. Ou seja, evitando a infecção dos animais com possíveis patógenos vindos de fora do biotério ou evitando a infecção dos manipuladores e de outras pessoas com possíveis patógenos saídos dos aquários/biotério, respectivamente. Higienização e desinfecção de bancadas que rotineiramente recebem gotejamento de água dos aquários também são medidas eficazes que evitam a contaminação do ambiente e a infecção de manipuladores.

A manutenção do esquema vacinal em dia também é recomendada. Já foi reportado que a vacina BCG (Bacillus Calmette-Guérin) se provou capaz de reduzir a letalidade de M. marinum sobre zebrafish (131131 Oksanen KE, Myllymäki H, Ahava MJ, Mäkinen L, Parikka M, Rämet M. DNA Vaccination Boosts Bacillus Calmette-Guérin Protection against Mycobacterial Infection in Zebrafish. Developmental and Comparative Immunology. 2016;54(1):89-96. https://doi.org/10.1016/j.dci.2015.09.001.
https://doi.org/10.1016/j.dci.2015.09.00...
). Além disso, a vacina BCG é capaz de proporcionar alguma proteção cruzada contra várias espécies de Mycobacterium presentes em colônias de zebrafish (132132 Orujyan D, Narinyan W, Rangarajan S, Rangchaikul P, Prasad C, Saviola B, Venketaraman V. Protective Efficacy of BCG Vaccine against Mycobacterium leprae and Non-Tuberculous Mycobacterial Infections. Vaccines. 2022;10(3):390. https://doi.org/10.3390/vaccines10030390.
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). Isso mostra que a vacina BCG tem um amplo espectro protetivo no que diz respeito às espécies de bactérias e às espécies de hospedeiros potenciais presentes em um biotério de zebrafish. Em casos mais específicos de surtos localizados em determinados biotérios ou em experimentos que usem zebrafish como modelo de estudo para infectologia humana, a vacinação contra cólera pode ser indicada.

Além do risco de transmissão da zoonose em si, ainda há o problema de o manipulador se infectar com agentes resistentes aos tratamentos disponíveis na maioria dos serviços de saúde como é o caso da infecção por bactérias resistentes a antibióticos (133133 Hossain S, Silva BCJ, Dahanayake PS, Heo GJ. Characterization of Virulence Properties and Multi-Drug Resistance Profiles in Motile Aeromonas spp. Isolated from Zebrafish (Danio rerio). Letters in Applied Microbiology. 2018;67(6):598-605. https://doi.org/10.1111/lam.13075.
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,134134 Chandrarathna HPSU, Nikapitiya C, Dananjaya SHS, Wijerathne CUB, Wimalasena SHMP, Kwun HJ, Heo GJ, Lee J, Zoysa MD. Outcome of Co-Infection with Opportunistic and Multidrug Resistant Aeromonas hydrophila and A. veronii in Zebrafish: Identification, Characterization, Pathogenicity and Immune Responses. Fish and Shellfish Immunology. 2018;80:573-81. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.06.049.
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). Além disso, ainda que não se infecte, o manipulador pode transportar agentes infecciosos (resistentes ou não a tratamentos disponíveis) a ambientes frequentados por indivíduos imunocomprometidos, recém-nascidos e suas mães, idosos ou hospitalizados de maneira geral. De fato, recomenda-se que o bioterista nunca saia do biotério para visitar um paciente hospitalizado no mesmo dia ou sem antes ter se higienizado rigorosamente com um banho, pelo menos (135135 Munoz-Price LS, Banach DB, Bearman G, Gould JM., Leekha S, Morgan DJ, Palmore TN, Rupp ME, Weber DJ, Wiemken TL. Isolation Precautions for Visitors. Infection Control & Hospital Epidemiology. 2015;36(7):747-58. https://doi.org/10.1017/ice.2015.67.
https://doi.org/10.1017/ice.2015.67...
).

4.14.2 Saúde ambiental

Como já mencionado, um biotério aquático que não prima pelas boas práticas e pela biossegurança de suas instalações pode se tornar um risco não só para a saúde dos animais e dos experimentadores, mas também para a saúde ambiental. Já é amplamente defendido que avaliações experimentais de peixes transgênicos, por exemplo, sejam realizadas em instalações de forma que a contenção física seja eficaz para garantir a segurança da aplicação desses animais (136136 Devlin RH, Sundstro LF, Muir WM. Interface of Biotechnology and Ecology for Environmental Risk Assessments of Transgenic Fish. Trends in Biotechnology. 2006;24(2):89-97. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2005.12.008.
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2005.1...
). No entanto, recentemente foi reportado que zebrafish transgênicos alcançaram o ambiente natural da Mata Atlântica brasileira em decorrência de barreiras de contenção inadequadas de criadores de peixes ornamentais, causando preocupação no que se refere à saúde do ecossistema (137137 Magalhães ALB, Bezerra VS, Daga LAV, Pelicice FM, Vitule JRS, Brito MFG. Biotic Differentiation in Headwater Creeks after the Massive Introduction of Non-Native Freshwater Aquarium Fish in the Paraíba Do Sul River Basin, Brazil. Neotropical Ichthyology. 2021;19(03): e20014. https://doi.org/10.1590/1982-0224-2020-0147.
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,138138 Magalhães ALB, Brito MFG, Silva LGM. The Fluorescent Introduction Has Begun in the Southern Hemisphere: Presence and Life-History Strategies of the Transgenic Zebrafish Danio rerio (Cypriniformes: Danionidae) in Brazil. Studies on Neotropical Fauna and Environment. 2022:1-13. https://doi.org/10.1080/01650521.2021.2024054.
https://doi.org/10.1080/01650521.2021.20...
).

Além disso, zebrafish transgênicos ou selvagens são potenciais reservatórios de patógenos que podem contaminar o ambiente natural, infectando, consequentemente, peixes silvestres e outros animais de forma geral, inclusive humanos (Tabela 2). De fato, a ocorrência amplamente distribuída de zebrafish ao redor do mundo já causa preocupação pela introdução de doenças que não eram reportadas no passado em determinadas regiões geográficas (8989 Silveira T, Kütter MT, Martins CMG, Marins LF, Boyle RT, Campos VF, Remião MH. First record of Clinostomum sp. (Digenea: Clinostomidae) in Danio rerio (Actinopterygii: Cyprinidae) and the implication of using zebrafish from pet stores on research. Zebrafish. 2021;18(2):139-148. https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950.
https://doi.org/10.1089/zeb.2020.1950...
,125125 Pace A, Dipineto L, Aceto S, Censullo MC, Valoroso MC, Varriale L, Rinaldi L, Menna LF, Fioretti A, Borrelli L. Diagnosis of Centrocestus formosanus Infection in Zebrafish (Danio rerio) in Italy: A Window to a New Globalization-Derived Invasive Microorganism. Animals. 2020;10(3):456. https://doi.org/10.3390/ani10030456.
https://doi.org/10.3390/ani10030456...
). Para evitar a contaminação do ambiente e o risco infeccioso é recomendado que os coordenadores de biotérios aquáticos de zebrafish estejam atentos ao disposto pela legislação vigente. No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e o Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) tornaram públicas a Resolução da Diretoria Colegiada nº 222/2018 (139139 ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2018. Resolução da Diretoria Colegiada no. 222, de 28 de março de 2018. Regulamenta as Boas Práticas de Gerenciamento dos Resíduos de Serviços de Saúde e dá outras providências. Diário Oficial da União. 2018; nº 61; seção 1; p. 76. Portuguese.) a Resolução nº 358/2005 (140140 CONAMA, Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução CONAMA no 358 de 29 de abril de 2005. Dispõe sobre o tratamento e a disposição final dos resíduos dos serviços de saúde e dá outras providências. Diário Oficial da União. 2005; nº 84, seção 1, p. 63-65. Portuguese.), respectivamente, que regulamentam as boas práticas de gerenciamento dos resíduos de serviços de saúde e dispõem de várias orientações sobre o descarte e destino de resíduos provenientes das atividades de manutenção e de experimentação de animais de laboratório. Ainda, a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) publicou a RN nº 18/2014 que dispõe sobre a classificação de riscos de organismos geneticamente modificados (OGM) e os níveis de biossegurança a serem aplicados nas atividades com OGMs, visando a contenção desses organismos e seus derivados (141141 CTNBio, Comissão Técnica Nacional de Biossegurança. 2018. Resolução Normativa no 18, de 23 de março de 2018. Dispõe sobre a classificação de riscos de Organismos Geneticamente Modificados (OGM) e os níveis de biossegurança a serem aplicados nas atividades e projetos com OGM e seus derivados em contenção. Diário Oficial da União, 1-13. Portuguese.). Além disso, o CONCEA possui duas normativas particularmente importantes que auxiliam na orientação da contenção de material biológico em instalações que mantêm zebrafish com fins científicos, são a RN nº 55/2022, que apresenta a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa (DBCA) (142142 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilizacão de Animais em Atividades de Ensino ou de Pesquisa Científica - DBCA. Atualiza o texto da Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou de Pesquisa Científica - DBCA. Diário Oficial da União. 2022; nº 192, seção 1, p. 10. Portuguese.) e a RN nº 34/2017 (1313 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Resolução Normativa CONCEA nº 34, de 27 de julho de 2017. Institui o capítulo “Peixes mantidos em instalações de instituições de ensino ou pesquisa científica para fins de estudo biológico ou biomédico I - Lambari (Astyanax), Tilápia (Tilapia, Sarotherodon e Oreochromis) e Zebrafish (Danio rerio). Diário Oficial da União. 2017; seção 1, p. 218. Portuguese.), que apresenta informações relevantes sobre criação e manutenção de zebrafish em instalações de ensino e/ou pesquisa científica (1313 CONCEA, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Resolução Normativa CONCEA nº 34, de 27 de julho de 2017. Institui o capítulo “Peixes mantidos em instalações de instituições de ensino ou pesquisa científica para fins de estudo biológico ou biomédico I - Lambari (Astyanax), Tilápia (Tilapia, Sarotherodon e Oreochromis) e Zebrafish (Danio rerio). Diário Oficial da União. 2017; seção 1, p. 218. Portuguese.).

No entanto, apesar de os biotérios de zebrafish representarem riscos, eles também atuam a favor da saúde ambiental e da saúde única como um todo. Zebrafish de diversas linhagens têm sido empregados como modelos promissores em estudos de doenças animais (110110 Mitchell, KC, Breen P, Britton S, Neely MN, Withey JH. Quantifying Vibrio cholerae Enterotoxicity in a Zebrafish Infection Model. Applied and Environmental Microbiology. 2017;83(16):e00783-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00783-17.
https://doi.org/10.1128/AEM.00783-17...
,143143 Nowik N, Podlasz P, Jakimiuk A, Kasica N, Sienkiewicz W, Kaleczyc J. Zebrafish: An Animal Model for Research in Veterinary Medicine. Polish Journal of Veterinary Sciences. 2015;18(3):663-674. https://doi.org/10.1515/pjvs-2015-0086.
https://doi.org/10.1515/pjvs-2015-0086...
), humanas (144144 Shive HR. Zebrafish Models for Human Cancer. Veterinary Pathology. 2013;50(3):468-82. https://doi.org/10.1177/0300985812467471.
https://doi.org/10.1177/0300985812467471...
,145145 Zhang Q, Dong X, Chen B, Zhang Y, Zu Y, Li W. Zebrafish as a Useful Model for Zoonotic Vibrio parahaemolyticus Pathogenicity in Fish and Human. Developmental and Comparative Immunology. 2016;55:159-68. https://doi.org/10.1016/j.dci.2015.10.021.
https://doi.org/10.1016/j.dci.2015.10.02...
) e em ecotoxicologia (146146 Silveira CR, Varela Junior AS, Corcini CD, Soares SL, Anciuti AN, Kütter MT, Martínez PE. Effects of Bisphenol A on Redox Balance in Red Blood and Sperm Cells and Spermatic Quality in Zebrafish Danio rerio. Ecotoxicology. 2019;28(8):913-22. https://doi.org/10.1007/s10646-019-02091-5.
https://doi.org/10.1007/s10646-019-02091...
,147147 Almeida DV, Vaz B, Figueiredo MA, Varela Junior AS, Marins LF. Fluorescent Transgenic Zebrafish as a Biosensor for Growth-Related Effects of Methyl Parathion. Aquatic Toxicology. 2014;152:147-151. https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2014.04.001.
https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2014.0...
). Por isso, se bem administrado e atentando para as boas práticas e para a biossegurança, um biotério aquático de zebrafish pode trazer mais benefícios para a sociedade do que riscos.

5. Regras

5.1 Planos de estudos, protocolos e procedimentos

O plano de estudo contém em detalhes o objetivo da pesquisa, como o trabalho será organizado, quais dados serão coletados durante o experimento e quem é responsável pelos vários aspectos do estudo. Este é o documento central através do qual o pesquisador comunica os objetivos e a condução do estudo para a equipe de trabalho e para terceiros. Neste documento deve conter uma descrição geral do experimento com cronograma de atividade, material e métodos e responsabilidade de cada membro da equipe envolvido. A aprovação do plano de estudo é vital para que se possa começar a pesquisa. No Brasil rotineiramente esse documento é elaborado como projeto de monografia, tese ou dissertação.

Procedimentos de operação padrão (POP), são desenvolvidos para a condução de estudos, registros e relatórios. Estes protocolos fazem parte das tarefas de rotina do laboratório e descrevem como os procedimentos devem ser conduzidos. De acordo com Andrade et al. (148148 Andrade A, Pinto SC, Oliveira RS. Animais de Laboratório: Criação e Experimentação. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ; 2002. 388 p. Portuguese. http://books.scielo.org.
http://books.scielo.org...
), o trabalho com animais de laboratório requer a utilização e o contato com substâncias químicas e alérgenos potencialmente perigosos para a saúde do pessoal envolvido, as instalações e os próprios animais. Esses perigos podem ser minimizados ou eliminados com o estrito cumprimento de procedimentos operacionais padronizados destinados a garantir a segurança.

Um POP é preparado para as pessoas diretamente ligadas à tarefa com o objetivo de atingir de forma eficiente e segura os requisitos da qualidade. No POP é importante observar as atividades críticas que devem ser resumidas e conter somente aquelas etapas básicas que não podem deixar de ser cumpridas. As atividades críticas devem ser detalhadas no manual de treinamento, no qual podem ser utilizadas figuras, fotos e esquemas. O manual de treinamento pode ainda ser colocado sob a forma de vídeo ou áudio visual para facilitar o treinamento (150150 Fraser TWK, Khezri A, Jusdado JGH, Lewandowska-Sabat AM, Henry T, Ropstad E. Toxicant induced behavioural aberrations in larval zebrafish are dependent on minor methodological alterations. Toxicology Letters. 2017;276:62-68. https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2017.05.021.
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).

No caso de zebrafish foi desenvolvido uma plataforma online pelo Zebrafish Information Network (ZFIN). Nesse site estão disponibilizadas informações sobre os dados biológicos de zebrafish e alguns protocolos para sua manutenção em laboratório.

Uma das diferenças mais importantes do protocolo de estudo entre projetos de mamíferos e peixes envolve o aumento da atenção que deve ser dada ao meio físico (água) nos estudos com peixes. O ambiente aquático é equivalente a um sistema de suporte à vida, portanto, os sistemas de alojamento e teste podem ser bastante complexos. Assim, protocolos de verificação dos parâmetros de qualidade da água descritos anteriormente, assim como seu registro, tornam-se necessários para uma maior confiabilidade dos dados gerados. Nesse quesito o tipo de protocolo será ajustado ao tipo de sistema de manutenção adotado. Dessa forma, são elencados a seguir os principais itens que devem estar inclusos no POP de um biotério de zebrafish.

  • Contatos para emergência.

  • Sistemas de criação e checagem de equipamentos.

  • Limpeza dos utensílios e tanques.

  • Cuidados gerais e alimentação dos peixes.

  • Verificação de parâmetros abióticos e de qualidade da água.

  • Recebimento e transporte dos peixes.

  • Avaliação da saúde dos peixes.

  • Eutanásia.

  • Aprovação, identificação e registro de experimentos.

O POP deve ser revisado periodicamente e deve apresentar o número e data da última revisão realizada como forma de registro. Ao serem considerados os dados fornecidos pela pesquisa científica, podem ser elaborados protocolos com práticas e normas de bem-estar animal e segurança no trabalho. Dessa forma, cada laboratório de experimentação/criação de zebrafish deve trabalhar conforme a legislação vigente em busca do bem-estar animal a fim de qualificar os resultados das pesquisas.

6. Resultados

Dada a importância potencial do conhecimento derivado de um estudo, é importante que os dados estejam completos, tenham integridade e sejam mantidos em segurança (2929 Villamizar N, Ribas L, Piferrer F, Vera LM, Sánchez-Vázquez FJ. Impact of Daily Thermocycles on Hatching Rhythms, Larval Performance and Sex Differentiation of Zebrafish. PLoS ONE. 2012;7(12):e52153. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052153.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.005...
). Embora seja menos comum nos primeiros artigos publicados com zebrafish, atualmente há uma tendência crescente de inclusão de informações detalhadas sobre a criação e os parâmetros usados nos estudos na seção de “Material e Métodos” das publicações (4747 Aleström P, D’Angelo L, Midtlyng PJ, Schorderet DF, Schulte-Merker S, Sohm F, Warner S. Zebrafish: Housing and Husbandry Recommendations. Laboratory Animals. 2020;54(3):213-24. https://doi.org/10.1177/0023677219869037.
https://doi.org/10.1177/0023677219869037...
). Com a noção de que parâmetros como alimentação, temperatura, fotoperíodo etc. podem afetar os resultados da pesquisa experimental (150150 Fraser TWK, Khezri A, Jusdado JGH, Lewandowska-Sabat AM, Henry T, Ropstad E. Toxicant induced behavioural aberrations in larval zebrafish are dependent on minor methodological alterations. Toxicology Letters. 2017;276:62-68. https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2017.05.021.
https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2017.05...
) é recomendado incluir sempre uma descrição detalhada dos parâmetros de criação de zebrafish usados. No caso de biotérios o registro das atividades como alimentação, dados abióticos é de suma importância para a gestão dos recursos e planejamento das atividades.

O relatório e os dados gerados são o resultado final do experimento. Essas informações muitas vezes passam a fazer parte da base de conhecimento científico assim que os resultados chegam a domínio público, muitas vezes por meio de publicação em periódicos. Dada a importância potencial do conhecimento derivado do estudo, é importante que os dados estejam completos, tenham integridade e sejam mantidos em segurança (2828 CCAC, Canadian Council on Animal Care. CCAC Guidelines: Zebrafish and other small, warm-water laboratory fish. 2020. 110p. https://ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/CCAC_Guidelines-Zebrafish_and_other_small_warm-water_laboratory_fish.pdf
https://ccac.ca/Documents/Standards/Guid...
). Os arquivos resultantes de um estudo devem ser armazenados de forma que ao acessar as informações seja possível repetir o experimento.

7. Controle de qualidade

As BPL definem os requisitos mínimos de garantia de qualidade necessários para garantir a validade dos resultados experimentais. Para respeitar os princípios de BPL, o controle de qualidade deve revisar todas as fases da pesquisa pré-clínica - desde o planejamento até a geração de relatórios e arquivamento da documentação. Em resumo, a missão fundamental do controle de qualidade é a de uma testemunha independente de todo o processo de pesquisa pré-clínica e sua estrutura organizacional. Nesse sentido as comissões de ética em pesquisa animal das instituições de ensino superior, Conselho Federal de Medicina Veterinária, assim como a avaliação por pares das revistas científicas, desempenham uma importante colaboração no cumprimento deste requisito. Cabe ressaltar que raramente pode ser feito por apenas uma pessoa e geralmente requer informações de especialistas científicos da área de estudo.

8. Conclusão

De maneira geral, a implantação das BPL deve começar com uma avaliação dos riscos e oportunidades em todo o sistema através da realização de uma busca por melhorias que serão práticas em determinadas situações. Esta avaliação deverá incluir o embasamento científico das necessidades e do bem-estar dos animais, e avaliação de riscos para identificar as causas da precariedade do bem-estar animal. Em muitos casos, a abordagem mais eficaz é susceptível de ser um processo contínuo de melhoria com base em metas alcançáveis.

De certa forma o Brasil ainda necessita de melhorias relacionadas ao bem-estar de organismos aquáticos (leis nacionais, normativas para construção de biotérios, acordos internacionais, programas corporativos e outros); especialmente em relação à utilização destes organismos na pesquisa e desenvolvimento tecnológico. Dessa forma, a implementação das BPL fornece uma orientação valiosa para a melhoria do bem-estar animal e segurança do trabalhador, além de vir a facilitar a padronização da pesquisa. Como parte da avaliação dos riscos e oportunidades, as BPL devem considerar o possível papel e os benefícios de tais protocolos para a experimentação, assim como qualquer capacitação necessária, para facilitar que os trabalhadores envolvidos possam cumprir as normas.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    17 Fev 2023
  • Data do Fascículo
    2023

Histórico

  • Recebido
    23 Set 2022
  • Aceito
    08 Nov 2022
  • Publicado
    09 Jan 2023
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