Análises anatomopatológica e imuno-histoquímica do baço e linfonodo de cães soropositivos para leishmaniose em testes sorológicos

Aline Oliveira de Magalhães Lucilandia Maria Bezerra Diego Pereira Araújo Bruna Siqueira Gomes de Lima Leandro do Padro Assunção Eduardo de Paula Nascente Ana Paula Iglesias Santin Rodrigo Caldas Menezes Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura Sobre os autores

Abstract

Canine leishmaniasis (CanL) is a zoonosis caused by the protozoan of the species Leishmania infantum. The spleen and lymph nodes undergo morphological changes during CanL. This research aimed to perform an anatomopathological and immunohistochemical study of these organs in dogs reactive to leishmaniasis in the Dual-path Platform chromatographic immunoassay (DPP®) and Enzyme Immunoabsorption Assay (ELISA). Twenty-seven dogs were evaluated for anatomopathological examination with 92.6% showing changes at gross evaluation, specially splenomegaly and lymphadenomegaly. All dogs showed changes in the spleen unrelated to the parasitic load, with granulomatous splenitis being the most severe change. Diffuse cortical and paracortical hyperplasia, and hyperplasia and hypertrophy of the medullary cords were observed in the lymph node. Amastigote forms of Leishmania spp. were found in the spleen and lymph node at histopathological and immunohistochemical evaluations, with good agreement between these evaluations (k = 0.55, p = 0.00124), but no difference was observed in the parasitic intensity of these organs at immunohistochemistry (p = 0.23). It was concluded that spleen and lymph node from dogs reactive to leishmaniasis on the DPP® and ELISA tests show histomorphological changes resulting from the disease, independent to the parasitic load, as well as these organs show similar parasitic load at immunohistochemical test.

Keywords:
amastigote; histopathology; immunostaining; Leishmania spp.; lymphoid tissue

Resumo

A leishmaniose canina (CanL) é uma zoonose causada pelo protozoário da espécie Leishmania infantum. O baço e os linfonodos sofrem alterações morfológicas durante o CanL. Esta pesquisa teve como objetivo realizar um estudo anatomopatológico e imuno-histoquímico desses órgãos em cães reativos para leishmaniose aos testes de Imunoensaio Cromatográfico “Dual Path Platform” (DPP®) e Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA). Vinte e sete cães foram avaliados ao exame anatomopatológico, com 92,6% exibindo alterações à avaliação macroscópica, especialmente esplenomegalia e linfadenomegalia. Todos os cães apresentaram alterações no baço não relacionadas à carga parasitária, sendo a esplenite granulomatosa a alteração mais grave. Hiperplasia cortical e paracortical difusa e hiperplasia e hipertrofia dos cordões medulares foram observadas nos linfonodos. Formas amastigotas de Leishmania spp. foram encontradas no baço e linfonodo às avaliações histopatológica e imuno-histoquímica, com boa concordância entre os métodos (k = 0,55, p = 0,00124), mas não foi observada diferença na intensidade parasitária entre esses órgãos à imuno-histoquímica (p = 0,23). Conclui-se que baço e linfonodo de cães reativos para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA apresentam alterações histomorfológicas decorrentes da doença, independente da carga parasitária, assim como esses órgãos apresentam carga parasitária semelhante ao método imuno-histoquímico.

Palavras-chave:
amastigota; histopatologia; imunocoloração; Leishmania spp.; tecido linfoide

Introdução

A leishmaniose canina (CanL) é uma doença sistêmica e zoonótica (11 Brasil, Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Ministério da Saúde, Brasília, Distrito Federal. 2014. 120p.,22 World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization technical report series. 2010. 186p.). O parasito causador da doença é transmitido principalmente pela picada de flebotomíneos infectados, que no Brasil são representados pelas espécies Lutzomyia longipalpis(33 Coura-Vital W, Leal CGA, Marques LA, Pinheiro AC, Carneiro M, Reis AB. Effectiveness of deltamethrin-impregnated dog collars on the incidence of canine infection by Leishmania infantum: A large scale intervention study in an endemic area in Brazil. PLoS One [Internet]. 2018 [cited 2020 Dec 10]; 13(12): e0208613. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0208613. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.020...
) e Lutzomyia cruzi(11 Brasil, Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Ministério da Saúde, Brasília, Distrito Federal. 2014. 120p.), transmitindo o protozoário da espécie Leishmania infantum(44 Belo VS, Werneck GL, Barbosa DS, Simões TC, Nascimento BWL, Silva ES, et al. Factors Associated with Visceral Leishmaniasis in the Americas: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS Negl Trop Dis. [Internet] 2013 [cited 2020 Dez 12]; 7(4):e2182. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002182. Englisg.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000...
). O cão (Canis familiaris) desempenha papel importante na manutenção da doença, pois atua como reservatório doméstico para a leishmaniose visceral (LV) em áreas urbanas (11 Brasil, Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Ministério da Saúde, Brasília, Distrito Federal. 2014. 120p.,44 Belo VS, Werneck GL, Barbosa DS, Simões TC, Nascimento BWL, Silva ES, et al. Factors Associated with Visceral Leishmaniasis in the Americas: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS Negl Trop Dis. [Internet] 2013 [cited 2020 Dez 12]; 7(4):e2182. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002182. Englisg.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000...
,55 Oliveira VC, Boechat VC, Mendes Junior AAV, Madeira MF, Ferreira LC, Figueiredo FB, et al. Occurrence of Leishmania infantum in the central nervous system of naturally infected dogs: Parasite load, viability, co-infections and histological alterations. PLoS One [Internet]. 2017 [cited 2021 Jan 21]; 12(4):e0175588. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175588. Englisg.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.017...
).

Esses protozoários são parasitos intracelulares que infectam células do sistema mononuclear fagocítico no hospedeiro vertebrado (66 Tafuri WL, Michalick MS, Dias M, Genaro O, Leite VH, Barbosa AJ, et al. Optical and electron microscopic study of the kidney of dogs naturally and experimentally infected with Leishmania (Leishmania) chagasi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1989; 31(3):139-145.), e se disseminam principalmente para os linfonodos, baço, medula óssea e fígado (77 Keenan CM, Hendricks LD, Lightner L, Johnson AJ. Visceral Leishmaniasis in the German Shepherd Dog. II. Pathology. Vet Pathol. 1984; 21:80-86.). Os sinais clínicos da doença resultam da interação do parasito com o sistema imune do hospedeiro, e cães suscetíveis à infecção desenvolvem sintomatologia clínica devido à acentuada resposta imune celular e humoral contra o parasito (88 Almeida MAO, Jesus EEV, Sousa-Atta MLB, Alves LC, Berne MEA, Atta AM. Antileishmanial antibody profile in dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Vet Immunol Immunopathol. [Internet]. 2005 [cited 2021 Jan 21]; 106:151-158. Available from: https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2004.08.024. English.
https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2004.08...
,99 Maia C, Campino L. Cytokine and phenotypic cell profiles of leishmania infantum infection in the dog. Journal Trop Med. [Internet]. 2012 [cited 2021 jan 23]. 2012: 541571. Available from: https://doi.org/10.1155/2012/541571. English.
https://doi.org/10.1155/2012/541571...
).

A CanL é uma doença progressiva, que causa reação inflamatória crônica, composta por macrófagos, plasmócitos e linfócitos (1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
https://doi.org/10.1016/j.actatropica.20...
,1111 Silva LC, Castro RS, Figueiredo MM, Michalick MSM, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis as a systemic fibrotic disease. International Jour Exp Pathol. [Internet]. 2013 [cited 2021 Jan 04]; 94:133-143. Available from: https://doi.org/10.1111/iep.12010. English.
https://doi.org/10.1111/iep.12010...
), com remodelação e reparo tecidual (1111 Silva LC, Castro RS, Figueiredo MM, Michalick MSM, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis as a systemic fibrotic disease. International Jour Exp Pathol. [Internet]. 2013 [cited 2021 Jan 04]; 94:133-143. Available from: https://doi.org/10.1111/iep.12010. English.
https://doi.org/10.1111/iep.12010...
). Cães acometidos comumente desenvolvem linfadenomegalia (1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
https://doi.org/10.1016/j.actatropica.20...
,1212 Cavalcanti AS, Ribeiro-Alves M, Pereira LOR, Mestre GL, Ferreira ABR, Morgado FN, et al. Parasite load induces progressive spleen architecture breakage and impairs cytokine mRNA expression in Leishmania infantum naturally infected dogs. PLoS One [Internet]. 2015 [cited 2021 Jan 20]; 10(4):e0123009. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123009. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.012...
), esplenomegalia, hepatomegalia, anemia, e lesões cutâneas (1212 Cavalcanti AS, Ribeiro-Alves M, Pereira LOR, Mestre GL, Ferreira ABR, Morgado FN, et al. Parasite load induces progressive spleen architecture breakage and impairs cytokine mRNA expression in Leishmania infantum naturally infected dogs. PLoS One [Internet]. 2015 [cited 2021 Jan 20]; 10(4):e0123009. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123009. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.012...
). O baço e os linfonodos estão entre os órgãos mais afetados na CanL, pois participam de respostas imunes específicas (1313 Haley PJ. The lymphoid system: A review of species differences, J. Toxicol. Pathol. [Internet]. 2017 [cited 2021 Jan 11]; 30:111-123. Available from: https://doi.org/10.1293/tox.2016-0075. English.
https://doi.org/10.1293/tox.2016-0075...
,1414 Silva AV, Souza TL, Figueiredo FB, Mendes AAV, Ferreira LC, Filgueira COB, et al. Detection of amastigotes and histopathological alterations in the thymus of Leishmania infantum ‐infected dogs. Immun Inflamm Dis. [Internet]. 2020 [cited 2021 Jan 10]; 8:127-139. (https://doi.org/10.1002/iid3.285). English.
https://doi.org/10.1002/iid3.285...
) , sendo sítios onde ocorre apresentação de antígenos (1414 Silva AV, Souza TL, Figueiredo FB, Mendes AAV, Ferreira LC, Filgueira COB, et al. Detection of amastigotes and histopathological alterations in the thymus of Leishmania infantum ‐infected dogs. Immun Inflamm Dis. [Internet]. 2020 [cited 2021 Jan 10]; 8:127-139. (https://doi.org/10.1002/iid3.285). English.
https://doi.org/10.1002/iid3.285...
,1515 Mebius RE, Kraal G. Structure and function of the spleen. Nat. Rev. Immunol. [Internet]. 2005 [cited 2021 Jan 10]; 5:606-616. Available from: https://doi.org/10.1038/nri1669. English.
https://doi.org/10.1038/nri1669...
).

O baço é um órgão linfoide que influencia diretamente o resultado da infecção (1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008...
). A polpa branca é dividida em bainha linfática periarteriolar (BLPA), folículos linfoides nodulares (FLN) e zona marginal (ZM). Na BLPA predominam linfócitos T e nos FLN linfócitos B (1717 Lima IS, Silva JS, Almeida VA, Junior FGL, Souza PAN, Laranjeira DF, et al. Severe clinical presentation of visceral leishmaniasis in naturally infected dogs with disruption of the splenic white pulp. PLoS One [Internet]. 2014 [cited 2020 Jan 28]; 9(2)e87742. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087742. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.008...
). A estrutura do tecido linfoide esplênico permite a movimentação e a diferenciação de linfócitos envolvidos nas respostas imunes, e possibilita a localização ideal das células de memória para resposta a antígenos. Entre as alterações esplênicas na CanL estão atrofia folicular, redução das delimitações do tecido linfoide(1818 Silva JS, Andrade AC, Santana CC, Santos LQ, Oliveira CI, Veras PST, et al. Low CXCL13 expression, splenic lymphoid tissue atrophy and germinal center disruption in severe canine visceral leishmaniasis. PLoS One [Internet]. 2012 [cited 2020 Jan 26]; 7(1): e29103. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029103. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.002...
), hiperplasia e hipertrofia celular, reação inflamatória granulomatosa, alta infestação parasitária e fibrose (1414 Silva AV, Souza TL, Figueiredo FB, Mendes AAV, Ferreira LC, Filgueira COB, et al. Detection of amastigotes and histopathological alterations in the thymus of Leishmania infantum ‐infected dogs. Immun Inflamm Dis. [Internet]. 2020 [cited 2021 Jan 10]; 8:127-139. (https://doi.org/10.1002/iid3.285). English.
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).

Os linfonodos também são acometidos na CanL (1414 Silva AV, Souza TL, Figueiredo FB, Mendes AAV, Ferreira LC, Filgueira COB, et al. Detection of amastigotes and histopathological alterations in the thymus of Leishmania infantum ‐infected dogs. Immun Inflamm Dis. [Internet]. 2020 [cited 2021 Jan 10]; 8:127-139. (https://doi.org/10.1002/iid3.285). English.
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) e a linfadenomegalia é um sinal clínico comum (1111 Silva LC, Castro RS, Figueiredo MM, Michalick MSM, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis as a systemic fibrotic disease. International Jour Exp Pathol. [Internet]. 2013 [cited 2021 Jan 04]; 94:133-143. Available from: https://doi.org/10.1111/iep.12010. English.
https://doi.org/10.1111/iep.12010...
). De suas três porções, a região cortical possui folículos linfoides com predomínio de células B; a paracortical não possui folículos e é composta por linfócitos T; e a medular contém cordões medulares e linfócitos B. Ainda, todas as regiões podem apresentar células reticulares, raros plasmócitos e macrófagos (1919 Junqueira LC, Carneiro J. Histologia Básica. 13th ed. Guanabara Koogan; 2017. 568p.). Linfonodos de cães com CanL exibem hiperplasia e hipertrofia das regiões cortical e medular, inflamação granulomatosa (77 Keenan CM, Hendricks LD, Lightner L, Johnson AJ. Visceral Leishmaniasis in the German Shepherd Dog. II. Pathology. Vet Pathol. 1984; 21:80-86.,2020 Reis AB, Martins-Filho OA, Carvalho AT, Giunchetti RC, Carneiro CM, Mayrink W, et al. Systemic and compartmentalized immune response in canine visceral leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol. [Internet]. 2009 [cited 2021 Jan 18]; 128:87-95. Available from: https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2008.10.307. English.
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) e fibrose (2121 Menezes RC, Madeira MF, Ferreira LC, Barbosa Filho CJL, Miranda LHM, Figueiredo FB. Cell-block immunohistochemistry of bone marrow aspirates: A novel tool to improve the diagnosis of leishmania infection in dogs. J. Comp. Pathol. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 16]; 154:157-160. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2015.12.005. English.
https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2015.12.0...
).

Considerando a participação do baço e dos linfonodos na resposta imune da CanL, este estudo teve como objetivo realizar estudo histomorfológico e imuno-histoquímico do baço e linfonodo de cães reativos para leishmaniose aos testes Dual Path Platform (DPP®) e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

Material e Métodos

Esta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Goiás (CEUA/UFG), Goiânia, GO, Brasil, sob protocolo número 061/19. Foram utilizados 27 cães reagentes para leishmaniose aos testes imunocromatográfico rápido Dual Path Platform (DDP® - Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil) e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), provenientes da rotina de vigilância epidemiológica para LVC realizada pela Diretoria de Vigilância em Zoonoses do Município de Goiânia (DVZ), GO, Brasil. Conforme recomendado pelo Ministério da Saúde, após positividade aos testes DPP® e ELISA e consentimento de seus respectivos tutores, os cães foram submetidos à eutanásia e encaminhados ao Setor de Patologia Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG, (SPA/EVZ/UFG), Goiânia, GO, para exame anatomopatológico.

Para a tabulação dos dados epidemiológicos foram consideradas as variáveis sexo, idade e raça. Quanto a idade os animais foram classificados em jovens (até dois anos de idade), adultos (de três a sete anos de idade) ou idosos (acima de oito anos de idade) e, quanto à raça foram divididos em sem raça definida (SRD) e com raça definida (CRD), conforme informações cedidas pela DVZ. Variáveis relacionadas aos sinais clínicos de CanL também foram consideradas na avaliação macroscópica, incluindo onicogrifose, alopecia, descamação, úlcera oral, úlcera nasal(2222 Boechat VC, Mendes Junior AAV, Madeira MF, Ferreira LC, Figueiredo FB, Rodrigues FC, et al. Occurrence of Leishmania infantum and associated histological alterations in the genital tract and mammary glands of naturally infected dogs. Parasitol. Res. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 10]; 115:2371-2379. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-4. English.
https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-...
,2323 Souza CC, Barreto TO, Silva SM, Pinto AWJ, Figueiredo MM, Rocha OGF, et al. A potential link among antioxidant enzymes, histopathology and trace elements in canine visceral leishmaniasis. Int J Exp Pathol. [Internet]. 2014 [[cited 2021 Jan 07]; 95:260-270. Available from: https://doi.org/10.1111/iep.12080. English.
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) e escore corporal (escala de 1 a 5 pontos: 1- caquético, costelas visíveis, sem cobertura de gordura, apresentando proeminências ósseas palpáveis, evidente recuo abdominal com perda de massa muscular; 2 - baixo escore corporal, animais magros, costelas facilmente palpáveis com cobertura mínima de gordura, proeminências ósseas facilmente palpáveis, recuo abdominal visível na região do flanco e gordura abdominal mínima; 3 - corpo médio, escore ideal, costelas palpáveis com pequena camada de gordura, recuo abdominal bem proporcionado e camada mínima de gordura abdominal; 4 - excesso de peso, costelas difíceis de serem palpadas com moderada cobertura de gordura, recuo abdominal mínimo ou ausente, abdômen arredondado com moderada cobertura de gordura, 5- obesidade, difícil palpação de costelas, acentuados depósitos de gordura, abdômen distendido com depósitos de gordura exagerados e depósitos de gordura na região lombar, face e membros (2424 Castro MCN, Vieira AB, Santos MCS, Gershony LC, Soares AMB, Ferreira AMR. Escore de condição corporal como indicador do prognóstico de gatos com doença renal crônica, Cienc Rural. [Internet]. 2010 [cited 2021 Jan 21]; 40:365-370. Available from: https://doi.org/10.1590/s0103-84782010005000010. Portuguese.
https://doi.org/10.1590/s0103-8478201000...
). De acordo com as lesões externas e internas na avaliação macroscópica, os cães foram classificados como assintomáticos ou sintomáticos (1717 Lima IS, Silva JS, Almeida VA, Junior FGL, Souza PAN, Laranjeira DF, et al. Severe clinical presentation of visceral leishmaniasis in naturally infected dogs with disruption of the splenic white pulp. PLoS One [Internet]. 2014 [cited 2020 Jan 28]; 9(2)e87742. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087742. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.008...
).

Alterações relacionadas à esplenomegalia e linfadenomegalia (regional ou generalizada) também foram avaliadas no exame necroscópico. Avaliações histomorfológica e imunohistoquímica foram realizadas nas amostras de baço e linfonodo axilar fixadas em formalina tamponada neutra a 10% por 48 horas (2222 Boechat VC, Mendes Junior AAV, Madeira MF, Ferreira LC, Figueiredo FB, Rodrigues FC, et al. Occurrence of Leishmania infantum and associated histological alterations in the genital tract and mammary glands of naturally infected dogs. Parasitol. Res. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 10]; 115:2371-2379. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-4. English.
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) e, sequencialmente, mantidas em álcool 70% até o processamento histológico e inclusão em parafina.

Avaliação histopatológica

Dos blocos parafinados contendo amostras de baço e linfonodo foram confeccionados cortes histológicos à espessura de 5 µm, os quais distendidos sobre lâminas histológicas e corados por hematoxilina e eosina (HE) (2222 Boechat VC, Mendes Junior AAV, Madeira MF, Ferreira LC, Figueiredo FB, Rodrigues FC, et al. Occurrence of Leishmania infantum and associated histological alterations in the genital tract and mammary glands of naturally infected dogs. Parasitol. Res. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 10]; 115:2371-2379. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-4. English.
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).

No baço foram consideradas a organização estrutural do tecido linfoide e a formação de granuloma, conforme adaptado de Silva et al. (2525 Silva AVA, Figueiredo FB, Menezes RC, Mendes-Junior AA, Miranda LHM, Cupolillo E, et al. Morphophysiological changes in the splenic extracellular matrix of Leishmania infantum-naturally infected dogs is associated with alterations in lymphoid niches and the CD4+ T cell frequency in spleens. PLoS Negl Trop Dis. [Internet]. 2018 [cited 2020 Jan 29]; 12(4):e0006445. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006445. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000...
). Para isso, atribuíram-se os escores zero (0 - organizado), com folículos linfoides apresentando todas as regiões estruturais desenvolvidas e delineadas, incluindo bainha linfocitária periarteriolar distinta, centro germinativo, zona do manto e zona marginal; um (1 - ligeiramente desorganizado), quando havia folículos linfoides com redução na definição de uma região ou discreta desorganização de qualquer estrutura do nódulo linfático, e discreta hiperplasia ou rarefação da polpa branca; dois (2 - moderadamente desorganizado), com polpa branca evidente, porém, com regiões pobremente definidas ou indistintas, e moderada hiperplasia linfoide; três (3 - acentuadamente desorganizado), tecido linfoide indistinto ou pouco diferenciado da polpa vermelha, com fibroplasia e acentuada hiperplasia folicular; e quatro (4 - granulomas bem definidos), em amostras com o tecido linfoide acentuadamente desorganizado, com limites estabelecidos pela proliferação de fibrose e células epitelioides.

As amostras esplênicas classificadas com escores três e quatro foram submetidas à coloração de Tricrômico de Masson, visando identificar e delimitar a formação da fibrose no parênquima esplênico. Também no baço foram consideradas as variáveis espessura da cápsula esplênica, periesplenite de acordo com o tipo do infiltrado inflamatório, hemossiderose, hematopoiese extramedular e macrófagos parasitados por formas amastigotas de Leishmania spp.

Na avaliação do linfonodo foram adotados os critérios adaptados de Toplu and Aydogan (2626 Toplu N, Aydogan A. An immunohistochemical study in cases with usual and unusual clinicopathological findings of canine visceral leishmaniosis. Parasitol Res. [Internet]. 2011 [cited 2021 Jan 19]; 109:1051-1057. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-011-2345-0. English.
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), sendo consideradas as variáveis hiperplasia difusa cortical e paracortical; hiperplasia folicular com centro germinativo reativo em região cortical; hiperplasia e hipertrofia de macrófagos em seios subcapsulares e medulares; hiperplasia e hipertrofia dos cordões medulares; espessamento capsular; tipo de infiltrado inflamatório capsular; presença ou ausência de macrófagos com formas amastigotas de Leishmania spp.; e edema em cordões e seios.

Avaliação imuno-histoquímica (IHQ)

Para a análise imuno-histoquímica, cortes histológicos de 4 µm foram dispostos em lâminas histológicas silanizadas (StarFrost®) e submetidos a desparafinização em xilol e reidratação em concentrações decrescentes de etanol. A recuperação antigênica foi realizada em tampão de citrato de sódio, pH 6,0, a 95 °C, por 30 minutos, em banho-maria. A peroxidase endógena foi bloqueada por imersão das secções em peróxido de hidrogênio a 30% e água destilada na proporção de 1:10, por 10 minutos. Para bloqueio de ligações inespecíficas às proteínas, as secções foram incubadas em reagente background block (Cell Marque, Rocklin, CA), por 12 minutos, em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram incubados por 18 h, em temperatura entre 2-8 °C, com anticorpo policlonal anti-Leishmania, diluído à concentração de 1:1000 em diluente de anticorpo (Diamond; Cell Marque, Rocklin, CA). Para a amplificação dos sinais foi utilizado o kit HiDef Detection HRP Polymer System, em duas etapas, com a incubação sequencial de HiDef Detection™ Amplifier (Mouse e Rabbit), seguida de HiDef Detection™ HRP Polymer Detector (HiDef Detection HRP Polymer System; Cell Marque, Rocklin, CA). Para a visualização das formas amastigotas de Leishmania spp. foi utilizado o cromógeno DAB diluído em água destilada e ureia, de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras foram contracoradas com hematoxilina de Harris, desidratadas em etanol absoluto, clarificadas em xilol e cobertas com resina sintética e lamínula histológica. Como controle positivo da reação foram utilizadas duas amostras de tecido canino acentuadamente parasitadas com formas amastigotas de Leishmania spp.

Para a avaliação da intensidade parasitária, os macrófagos com formas amastigotas de Leishmania spp. foram contados em cinco campos com maior densidade de células parasitadas, à ampliação de 40x e auxílio de uma grade óptica de 1 mm2 e um contador manual de células. Em seguida, para cada animal foi obtida a média de macrófagos parasitados em cinco campos e atribuídos os escores de intensidade parasitária, a saber: ausente (quando não observadas formas amastigotas), discreto a moderado (0,2 a 10 macrófagos parasitados), e acentuado (mais de 10 macrófagos parasitados) (2222 Boechat VC, Mendes Junior AAV, Madeira MF, Ferreira LC, Figueiredo FB, Rodrigues FC, et al. Occurrence of Leishmania infantum and associated histological alterations in the genital tract and mammary glands of naturally infected dogs. Parasitol. Res. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 10]; 115:2371-2379. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-4. English.
https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-...
).

Análise estatística

Para as variáveis sexo, idade, raça, classificação clínica e alterações histomorfológicas do baço e linfonodo foi empregada estatística descritiva. Para a análise de concordância quanto ao número de casos positivos aos exames histopatológico e imuno-histoquímico foi utilizado o teste não paramétrico Kappa, ao nível de significância de 5%, sendo, em seguida, aplicado o escore excelente (0,8 < k ≤ 1), muito bom (0,6 < k ≤ 0,8), bom (0,4 < k ≤ 0,6), razoável (0,2 < k ≤ 0,4) ou péssimo (k ≤ 0,2), para determinar o grau de concordância entre os exames. Para a comparação da intensidade parasitária entre baço e linfonodo foi aplicado o teste de Mann-Whitney, considerando o nível de significância de 5%. Para isso, foram utilizadas planilhas eletrônicas Excel 2016 e o software R, incluindo as bibliotecas “irr” e “stats”.

Resultados

Entre os 27 cães reativos para leishmaniose nos testes DPP® e ELISA, 51,9% (n = 14) dos animais eram jovens, 25,9% (n = 7) adultos e 22,2% (n = 6) idosos. Em relação ao sexo, 66,7% (n = 18) eram fêmeas e 33,3% (n = 9) machos. Além disso, 51,9% (n = 14) eram cães de raça pura e 48,1% (n = 13) sem raça definida. À avaliação macroscópica 77,8% (n=21) dos cães apresentaram descamação cutânea, 55,5% (n=15) onicogrifose e 48,1% (n=13) alopecia. Além disso, um cão apresentou úlcera nasal e outro úlcera oral, o que representa 3,7% para cada uma dessas alterações. Para a variável escore corporal, 14,8% (n=4) dos animais apresentaram baixo escore corporal, 51,8% (n=14) médio escore corporal e 11,1% (n=3) discreto sobrepeso. O escore corporal não foi estabelecido em seis animais. De acordo com as lesões à avaliação macroscópica, 7,4% (n = 2) dos cães foram assintomáticos e 92,6% (n = 25) sintomáticos.

À avaliação macroscópica 81,5% (n = 22) dos animais apresentavam esplenomegalia e 22,2% (n = 6) algum grau de nodulação esplênica (Figura 1). Além disso, 63,0% (n = 17) dos cães apresentaram linfadenomegalia generalizada, um cão apresentou linfadenomegalia axilar e outro linfadenomegalia axilar e mandibular.

Figura 1
Baço de cães reagentes para CanL aos testes DPP® e ELISA. A) Tecido linfoide em escore dois de desorganização. Regiões foliculares discretamente desorganizadas e com pouca evidenciação e delimitação das regiões linfoides. HE. B) Tecido linfoide em escore três de desorganização. Microarquitetura esplênica difusamente desorganizada, com estruturas de folículo linfoide indistintas da polpa vermelha. HE. C) Aspecto macroscópico de um baço exibindo esplenomegalia e superfície nodular difusa. D) Tecido linfoide em escore quatro de desorganização. O parênquima esplênico exibe granulomas bem definidos. HE. E) Granuloma esplênico em maior aumento, evidenciando infiltrado de linfócitos, plasmócitos e células epitelioides delimitados por fibrose (seta). HE. F) Granuloma esplênico com evidenciação de células epitelioides (cabeça da seta) e fibras colágenas (seta). Tricrômico de Masson.

Avaliação histopatológica

A avaliação histomorfológica das amostras esplênicas evidenciou 100% (n = 27) dos cães com algum grau de desorganização da arquitetura do baço (Tabela 1) e, entre estes, 18,5% (n = 5) desenvolveram granulomas com evidência de fibrose confirmada à coloração de Tricrômico de Masson (Figura 1).

Tabela 1
Escores de desorganização do tecido linfoide esplênico e periesplenite no baço de cães reagentes para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA

Acrescente-se que, 55,6% (n = 15) dos animais apresentaram periesplenite com celularidade variada (Tabela 1), 66,6% (n = 18) espessamento da cápsula esplênica (Figura 2) e 88,8% (n = 24) hematopoiese extramedular, caracterizada pela evidenciação de megacariócitos no parênquima esplênico. Além disso, 92,6% (n = 25) dos cães apresentavam algum grau de hemossiderose esplênica e em 14,8% (n = 4) havia macrófagos esplênicos parasitados por Leishmania spp. (Figura 2). Duas das cinco amostras classificadas ao escore quatro exibiram formas amastigotas de Leishmania spp. no citoplasma de macrófagos.

Figura 2
Fotomicrografias do baço de cães reativos para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA. A) Perisplenite. Cápsula esplênica espessada e intercalada com infiltrado inflamatório linfoplasmocítico e macrofágico (asteriscos). HE. B) Acentuada deposição de colágeno (fibrose) na cápsula esplênica (seta). Tricrômico de Masson. C) Formas amastigotas de Leishmania spp. no citoplasma de macrófagos do parênquima esplênico (seta). HE. D) Macrófagos próximos à cápsula, exibindo formas amastigotas de Leishmania spp. HE.

As alterações histomorfológicas no linfonodo incluíram hiperplasia cortical e paracortical difusa (96,3%, n = 26), hiperplasia folicular com centro germinativo reativo na região cortical (55,6%, n = 15), hiperplasia e hipertrofia de macrófagos no seio subcapsular (70,3%, n = 19), hiperplasia e hipertrofia de macrófagos medulares (88,9%, n = 24) e hiperplasia e hipertrofia dos cordões medulares (100%, n = 27). Além disso, 22,2% (n = 6) dos linfonodos apresentaram espessamento capsular devido à fibrose e 85,2% (n = 23) espessamento devido à fibrose e infiltrado inflamatório capsular. Entre aqueles com infiltrado capsular, 59,3% (n = 16) eram do tipo linfoplasmocítico e 25,9% (n=7) do tipo linfoplasmocítico e macrofágico. Ainda, 18,5% (n = 5) dos linfonodos apresentavam macrófagos com formas amastigotas de Leishmania spp. e 40,7% (n=11) edema de cordões e seios. A Figura 3 ilustra as principais alterações histomorfológicas no linfonodo de cães reativos para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA.

Figura 3
Fotomicrografia do linfonodo de cães reativos aos testes CanL para DPP® e ELISA. A) Hiperplasia cortical e paracortical difusa. HE. B) Espessamento capsular por fibrose (seta) e infiltrado inflamatório (asterisco). Tricrômico de Masson. C) Infiltrado inflamatório capsular (seta). HE. D) Formas amastigotas de Leishmania spp. no citoplasma de macrófagos (seta) na região cortical do septo interfolicular. HE.

À técnica de IHQ foi constatada variada imunomarcação das formas amastigotas da Leishmania spp. nas amostras de baço e linfonodo dos cães reagentes para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA (Figura 4), havendo 22,2% (n=6) de imunomarcação esplênica e 37,0% (n=10) no linfonodo.

Figura 4
Fotomicrografias do baço e linfonodo de cães reativos para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA. Imunocoloração de formas amastigotas de Leishmania spp. no citoplasma de macrófagos do baço (setas) (A) e linfonodo (setas) (B). IHC, anti-Leishmania.

A análise de concordância quanto ao número de casos positivos aos exames histopatológico (n = 5, maior número de amostras positivas entre o baço e linfonodo) e imuno-histoquímico (n = 10, maior número de amostras entre baço e linfonodo) mostrou boa concordância (k = 0,55; p = 0,00124). A avaliação da intensidade parasitária no baço e linfonodo pela técnica de IHQ mostrou animais com escores ausente, discreto a moderado e acentuado. Além disso, a comparação da intensidade parasitária não diferiu entre baço e linfonodo à avaliação imuno-histoquímica (p = 0,23) (Tabela 2).

Tabela 2
Distribuição dos escores e comparação das médias da intensidade parasitária no baço e linfonodo pela técnica de IHQ

Os dados referentes à classificação dos escores de desorganização do tecido linfoide e intensidade parasitária na técnica de imunohistoquímica estão descritos na Tabela 3.

Tabela 3
Escores de desorganização do tecido linfoide e frequência da intensidade do parasita

Discussão

Vinte e quatro dos 27 cães reativos para CanL aos testes DDP® e ELISA eram sintomáticos, os quais apresentaram principalmente descamação esfoliativa, onicogrifose e alopecia. Estudos também mostraram que as lesões comuns na CanL (2222 Boechat VC, Mendes Junior AAV, Madeira MF, Ferreira LC, Figueiredo FB, Rodrigues FC, et al. Occurrence of Leishmania infantum and associated histological alterations in the genital tract and mammary glands of naturally infected dogs. Parasitol. Res. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 10]; 115:2371-2379. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-4. English.
https://doi.org/10.1007/s00436-016-4987-...
,2323 Souza CC, Barreto TO, Silva SM, Pinto AWJ, Figueiredo MM, Rocha OGF, et al. A potential link among antioxidant enzymes, histopathology and trace elements in canine visceral leishmaniasis. Int J Exp Pathol. [Internet]. 2014 [[cited 2021 Jan 07]; 95:260-270. Available from: https://doi.org/10.1111/iep.12080. English.
https://doi.org/10.1111/iep.12080...
) incluem onicogrifose (1212 Cavalcanti AS, Ribeiro-Alves M, Pereira LOR, Mestre GL, Ferreira ABR, Morgado FN, et al. Parasite load induces progressive spleen architecture breakage and impairs cytokine mRNA expression in Leishmania infantum naturally infected dogs. PLoS One [Internet]. 2015 [cited 2021 Jan 20]; 10(4):e0123009. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123009. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.012...
) (Cavalcanti et al., 2015) e lesões cutâneas como descamação esfoliativa, úlceras e alopecia (2727 Tafuri WL, Santos RDL, Arantes RME, Gonçalves R, Melo MN, Michalick MSM, et al. An alternative immunohistochemical method for detecting Leishmania amastigotes in paraffin-embedded canine tissues. J Immunol Methods. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 21]; 292:17-23. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.05.009. Portuguese.
https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.05.00...
), além de baixo escore corporal (77 Keenan CM, Hendricks LD, Lightner L, Johnson AJ. Visceral Leishmaniasis in the German Shepherd Dog. II. Pathology. Vet Pathol. 1984; 21:80-86.,1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
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), este último não observado na maioria dos animais deste estudo. Assim, fatores como a resposta individual à doença e o grau de desenvolvimento das lesões sistêmicas podem mediar diretamente a progressão do CanL e refletir na perda de peso dos animais afetados. Esplenomegalia (1212 Cavalcanti AS, Ribeiro-Alves M, Pereira LOR, Mestre GL, Ferreira ABR, Morgado FN, et al. Parasite load induces progressive spleen architecture breakage and impairs cytokine mRNA expression in Leishmania infantum naturally infected dogs. PLoS One [Internet]. 2015 [cited 2021 Jan 20]; 10(4):e0123009. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123009. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.012...
) e linfadenomegalia (77 Keenan CM, Hendricks LD, Lightner L, Johnson AJ. Visceral Leishmaniasis in the German Shepherd Dog. II. Pathology. Vet Pathol. 1984; 21:80-86.,1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
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) também são descritos na maioria dos cães desta pesquisa.

Alterações nos tecidos linfoides são frequentes nas infecções por Leishmania spp., como o baço, que desempenha papel importante na CanL, pois possui componentes da resposta imune e atua na interação com o parasito, o que reflete alterações morfológicas (1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
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), conforme observado no baço dos animais desta pesquisa. Essas alterações incluem principalmente algum grau de desorganização da microestrutura do tecido linfoide devido a reações imunológicas contra o parasito (2525 Silva AVA, Figueiredo FB, Menezes RC, Mendes-Junior AA, Miranda LHM, Cupolillo E, et al. Morphophysiological changes in the splenic extracellular matrix of Leishmania infantum-naturally infected dogs is associated with alterations in lymphoid niches and the CD4+ T cell frequency in spleens. PLoS Negl Trop Dis. [Internet]. 2018 [cited 2020 Jan 29]; 12(4):e0006445. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006445. English.
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).

Todos os animais deste estudo exibiram algum grau de desorganização estrutural esplênica, apresentando moderada desorganização do tecido linfoide na maioria dos casos, com regiões foliculares pouco evidentes ou hiperplasia de folículos linfoides. Ao mesmo tempo, casos com formação de granulomas bem definidos em associação ou não a formas amastigotas de Leishmania spp. foram observados, sem relação entre essas alterações e a presença ou intensidade do parasita. Nesse contexto, Santana et al. (1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
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) e Silva et al. (2525 Silva AVA, Figueiredo FB, Menezes RC, Mendes-Junior AA, Miranda LHM, Cupolillo E, et al. Morphophysiological changes in the splenic extracellular matrix of Leishmania infantum-naturally infected dogs is associated with alterations in lymphoid niches and the CD4+ T cell frequency in spleens. PLoS Negl Trop Dis. [Internet]. 2018 [cited 2020 Jan 29]; 12(4):e0006445. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006445. English.
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) também descreveram alterações esplênicas em cães com CanL, incluindo atrofia ou hiperplasia do folículo linfoide, resultando na perda de definição das regiões foliculares. Por outro lado, alguns autores têm descrito a formação de granulomas frequentemente associada a carga parasitária (1212 Cavalcanti AS, Ribeiro-Alves M, Pereira LOR, Mestre GL, Ferreira ABR, Morgado FN, et al. Parasite load induces progressive spleen architecture breakage and impairs cytokine mRNA expression in Leishmania infantum naturally infected dogs. PLoS One [Internet]. 2015 [cited 2021 Jan 20]; 10(4):e0123009. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123009. English.
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,1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
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).

A desorganização da arquitetura esplênica foi descrita em animais positivos para testes sorológicos e negativos para testes parasitológicos na investigação de CanL, sugerindo que a causa desse achado pode estar relacionada à resposta inflamatória prolongada no baço, com consequente redução da carga parasitária (1111 Silva LC, Castro RS, Figueiredo MM, Michalick MSM, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis as a systemic fibrotic disease. International Jour Exp Pathol. [Internet]. 2013 [cited 2021 Jan 04]; 94:133-143. Available from: https://doi.org/10.1111/iep.12010. English.
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,2828 Vasconcelos TCB, Bruno SF, Miranda LHM, Silva FC, Belo VS, Figueiredo FB. Parasite load, iNOS and cytokine profiles, and histopathological aspects of Leishmania infantum infection in dogs with different clinical presentations. Cienc Rural. [Internet] 2019 [cited 2020 Jan 19]; 49(10): e20180984. Available from: https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20180984. English.
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). Ademais, um estudo que avaliou ratos infectados com Leishmania donavani, evidenciou alterações esplênicas estimuladas por altos níveis do fator de necrose tumoral (TNF), sem associação à carga parasitária (2929 Engwerda CR, Ato M, Cotterell SEJ, Mynott TL, Tschannerl A, Gorak-Stolinska PMA, et al. A role for tumor necrosis factor-α in remodeling the splenic marginal zone during Leishmania donovani infection. Am J Pathol. [Internet]. 2002 [cited 2021 Jan 18]; 161:429-437. (https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)64199-5. English.
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). Embora não se tenha avaliado o TNF nesta pesquisa, pondera-se que essa hipótese possa justificar o fato de que todos os cães apresentaram alterações esplênicas, independente da presença ou intensidade do parasito.

Apesar da desorganização da arquitetura esplênica ser um importante achado neste estudo, amostras classificadas aos escores três e quatro apresentaram acentuada desorganização da polpa branca e formação de fibrose associada ou não à presença do parasito. Nesse sentido, Santana et al. (1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
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) descreveram a ruptura da arquitetura esplênica e formação de fibrose em decorrência da produção de uma teia reticular, visando prevenir ou retardar a progressão do parasito a outros tecidos (1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008...
,3030 Alexandre-Pires G, Pais D, Correia M, Pina JAE. Leishmaniosis - A report about the microvascular and cellular architecture of the infected spleen in Canis familiaris. Microsc Res Tech. [Internet]. 2006 [cited 2021 Jan 21]; 69:227-235. Available from: https://doi.org/10.1002/jemt.20267. English.
https://doi.org/10.1002/jemt.20267...
). Além disso, muitas amostras deste estudo apresentavam periesplenite, possivelmente devido à extensão da reação inflamatória esplênica do parênquima, associada ou não à presença do parasito nesses casos, o que também é frequentemente descrito nos casos de CanL, mas comumente relacionado à carga parasitária (1616 Santana CC, Vassallo J, Freitas LAR, Oliveira GGS, Carvalho LCP, Santos WLS. Inflammation and structural changes of splenic lymphoid tissue in visceral leishmaniasis: A study on naturally infected dogs. Parasite Immunol. [Internet]. 2008 [cited 2021 Jan 17]; 30:515-524. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008.01051.x. English.
https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2008...
,3131 Tafuri WL, Tafuri WL, Barbosa AJA, Michalick MSM, Genaro O, França-Silva JC, et al. Histopathology and immunocytochemical study of type 3 and type 4 complement receptors in the liver and spleen of dogs naturally and experimentally infected with Leishmania (Leishmania) chagasi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1996; 38:81-89. (https://doi.org/10.1590/S0036-46651996000200001).
https://doi.org/10.1590/S0036-4665199600...
,3232 Tryphonas L, Zawidzka Z, Bernard MA, Janzen EA. Visceral leishmaniasis in a dog: clinical, hematological and pathological observations. Can J Comp Med. 1977. 41:1-12.).

Um número relevante de animais com linfadenomegalia foi observado neste estudo, sendo essa alteração frequente nos casos de CanL (77 Keenan CM, Hendricks LD, Lightner L, Johnson AJ. Visceral Leishmaniasis in the German Shepherd Dog. II. Pathology. Vet Pathol. 1984; 21:80-86.,1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
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). A avaliação histopatológica do linfonodo axilar evidenciou hiperplasia e hipertrofia das regiões medular e cortical, sem associação aos sinais clínicos, corroborando os achados de Lima et al. (1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
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). No entanto, a hipertrofia e hiperplasia de macrófagos nos seios capsulares e/ou medulares estão entre as alterações mais frequentes nos linfonodos de cães infectados por Leishmania spp. (2525 Silva AVA, Figueiredo FB, Menezes RC, Mendes-Junior AA, Miranda LHM, Cupolillo E, et al. Morphophysiological changes in the splenic extracellular matrix of Leishmania infantum-naturally infected dogs is associated with alterations in lymphoid niches and the CD4+ T cell frequency in spleens. PLoS Negl Trop Dis. [Internet]. 2018 [cited 2020 Jan 29]; 12(4):e0006445. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006445. English.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000...
), conforme também observado neste estudo. Ainda, Lima et al. (1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
https://doi.org/10.1016/j.actatropica.20...
) sugeriram que a hiperplasia e a hipertrofia nas zonas cortical e medular associadas a inflamação capsular crônica e difusa são frequentes e justificam a ocorrência de linfadenomegalia nos casos de CanL.

Também, a maioria das amostras de linfonodo deste estudo exibia espessamento capsular devido a infiltrado inflamatório linfoplasmocítico e macrofágico agregado à fibrose, um dado frequente nos casos de CanL (1010 Lima WG, Michalick MSM, Melo MN, Washington LT, Wagner LT. Canine visceral leishmaniasis: A histopathological study of lymph nodes. Acta Trop. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 15]; 92:43-53. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2004.04.007. English.
https://doi.org/10.1016/j.actatropica.20...
). Nesse contexto, Giunchetti et al. (3333 Giunchetti RC, Martins-Filho OA, Carneiro CM, Mayrink W, Marques MJ, Tafuri WL, et al. Histopathology, parasite density and cell phenotypes of the popliteal lymph node in canine visceral leishmaniasis, Vet Immunol Immunopathol. [Internet]. 2018 [cited 2021 Jan 06]; 121:23-33. Available from: https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2007.07.009. English.
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) descreveram que o infiltrado capsular é frequentemente composto por macrófagos, incluindo a presença de parasitos, porém, neste estudo, essas alterações não foram associadas à presença de formas amastigotas de Leishmania spp.

A avaliação histopatológica foi utilizada para observar as alterações morfológicas e identificar formas amastigotas do parasito, sendo essa identificação também realizada por IHC. Os resultados da identificação em ambas as avaliações foram comparados e, na análise qualitativa, a imuno-histoquímica do baço e linfonodo expressou o melhor resultado numérico, mas sem diferença estatística. Esse dado corrobora o descrito por autores que apontam a técnica de IHQ como ferramenta complementar ao diagnóstico da CanL, por apresentar maior sensibilidade e especificidade (2121 Menezes RC, Madeira MF, Ferreira LC, Barbosa Filho CJL, Miranda LHM, Figueiredo FB. Cell-block immunohistochemistry of bone marrow aspirates: A novel tool to improve the diagnosis of leishmania infection in dogs. J. Comp. Pathol. [Internet]. 2016 [cited 2021 Jan 16]; 154:157-160. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2015.12.005. English.
https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2015.12.0...
,2626 Toplu N, Aydogan A. An immunohistochemical study in cases with usual and unusual clinicopathological findings of canine visceral leishmaniosis. Parasitol Res. [Internet]. 2011 [cited 2021 Jan 19]; 109:1051-1057. Available from: https://doi.org/10.1007/s00436-011-2345-0. English.
https://doi.org/10.1007/s00436-011-2345-...
,2727 Tafuri WL, Santos RDL, Arantes RME, Gonçalves R, Melo MN, Michalick MSM, et al. An alternative immunohistochemical method for detecting Leishmania amastigotes in paraffin-embedded canine tissues. J Immunol Methods. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 21]; 292:17-23. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.05.009. Portuguese.
https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.05.00...
,3333 Giunchetti RC, Martins-Filho OA, Carneiro CM, Mayrink W, Marques MJ, Tafuri WL, et al. Histopathology, parasite density and cell phenotypes of the popliteal lymph node in canine visceral leishmaniasis, Vet Immunol Immunopathol. [Internet]. 2018 [cited 2021 Jan 06]; 121:23-33. Available from: https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2007.07.009. English.
https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2007.07...
). Tafuri et al. (2727 Tafuri WL, Santos RDL, Arantes RME, Gonçalves R, Melo MN, Michalick MSM, et al. An alternative immunohistochemical method for detecting Leishmania amastigotes in paraffin-embedded canine tissues. J Immunol Methods. [Internet]. 2004 [cited 2021 Jan 21]; 292:17-23. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.05.009. Portuguese.
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) também relataram que a IHQ aumenta a eficácia dos testes de diagnóstico em 50% em comparação à avaliação histopatológica e a coloração de hematoxilina-eosina. Por outro lado, a boa concordância entre as avaliações histopatológica e imuno-histoquímica observada neste estudo, inferindo semelhança entre os testes, pode se justificar pelo pequeno número de amostras, fato também citado por Xavier et al. (3434 Xavier SC, Andrade HM, Monte SJH, Chiarelli IM, Lima WG, Michalick MSM, et al. Comparison of paraffin-embedded skin biopsies from different anatomical regions as sampling methods for detection of Leishmania infection in dogs using histological, immunohistochemical and PCR methods. BMC Vet Res. [Internet]. 2006 [cited 2021 Jan 19]; 2:17. Available from: https://doi.org/10.1186/1746-6148-2-17. English.
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), quando compararam os mesmos métodos de diagnóstico para avaliar a intensidade parasitária em cães com CanL.

Além disso, não foi observada diferença entre baço e linfonodo em relação à intensidade parasitária, indicando que ambos os órgãos são úteis ao diagnóstico da CanL. No entanto, não foram encontrados na literatura dados que ratificassem ou retificassem tal resultado em relação a esses órgãos. Contudo, Paparcone et al. (3535 Paparcone R, Fiorentino E, Cappiello S, Gizzarelli M, Gradoni L, Oliva G, et al. Sternal Aspiration of Bone Marrow in Dogs: A Practical Approach for Canine Leishmaniasis Diagnosis and Monitoring. J Vet Med. [Internet]. 2013 [cited 2021 Jan 27]; 2013:e217314. Available from: https://doi.org/10.1155/2013/217314. English.
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) compararam diferentes locais de colheita da medula óssea para o diagnóstico de CanL e também não observaram diferença quanto à intensidade do parasito. Apesar disso, os autores mencionaram que embora o linfonodo seja igualmente rico em parasitos, principalmente em cães sintomáticos, o acesso ao tecido linfoide nesse órgão pode ser limitado, principalmente quando não há aumento de volume, o que comumente ocorre em animais em estágio inicial da doença ou naqueles assintomáticos crônicos.

Conclusões

Baço e linfonodo de cães reativos para leishmaniose aos testes DPP® e ELISA desenvolvem alterações histomorfológicas decorrentes das reações imunológicas causadas pela doença, independente da presença do parasito e da carga parasitária. No baço, a desorganização do tecido linfoide em diferentes graus compreende a principal alteração, sendo a esplenite granulomatosa a lesão mais grave e, no linfonodo, prevalecem hiperplasia e hipertrofia dos cordões medulares e hiperplasia das regiões cortical e paracortical. Além disso, o baço e o linfonodo apresentam carga parasitária semelhante à avaliação imuno-histoquímica.

Agradecimentos

À Diretoria de Vigilância de Zoonoses do município de Goiânia (DVZ), GO, Brasil, pelo fornecimento dos animais ao estudo e por todo apoio durante o desenvolvimento da pesquisa. Ao Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos e ao Serviço de Anatomia Patológica, ambos do Instituto Nacional de Doenças Infecciosas Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil, pelo apoio técnico nesta pesquisa.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    27 Set 2021
  • Data do Fascículo
    2021

Histórico

  • Recebido
    11 Maio 2021
  • Aceito
    04 Ago 2021
  • Publicado
    25 Ago 2021
Universidade Federal de Goiás Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, Campus II, Caixa Postal 131, CEP: 74001-970, Tel.: (55 62) 3521-1568, Fax: (55 62) 3521-1566 - Goiânia - GO - Brazil
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