Silagens mistas de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro tratadas com Lactobacillus buchneri

Douglas Rodrigues da Costa Karina Guimarães Ribeiro Gabriel Ferreira de Lima Cruz Thiago Carvalho da Silva Lucas Ladeira Cardoso Odilon Gomes Pereira Sobre os autores

Abstract

There is evidence for the beneficial effects of forage peanut on the nutritive value and fermentation profile of silages; however, its effects on sugarcane silage have not been determined. The objective of the study was to evaluate the chemical composition, fermentation profile, microbial composition, and dry matter recovery (DMR) of sugarcane silage containing various amounts of forage peanut (Arachis pintoi cv. Belmonte) (0%, 25%, 50%, and 75% on a fresh matter basis), treated or untreated with Lactobacillus buchneri. A completely randomized 4 × 2 factorial design was used with three replications. The interaction between forage peanut levels and inoculant influenced the concentrations of dry matter, crude protein, neutral detergent fiber and acid detergent fiber, organic acids and ethanol, populations of lactic acid bacteria and yeast, gas and effluent losses, and DMR. Forage peanut levels had effects on dry matter, hemicellulose, acid detergent insoluble nitrogen, pH, and ammonia nitrogen. Increasing proportions of forage peanut increased the protein content and decreased the fiber content in the silage, while also reducing the production of ethanol and effluent. We recommend the inclusion of 40%–75% forage peanut in the sugarcane ensilage to improve the chemical composition and fermentation profile. Furthermore, inoculation with L. buchneri associated with forage peanut increases the concentration of antifungal acids in the silage and decreases the yeast population and ethanol production.

Keywords:
Chemical composition; Dry matter recovery; Ethanol; Microorganisms; Organic acids

Resumo

O objetivo do estudo foi avaliar composição química, perfil fermentativo, população de microrganismos e recuperação de matéria seca (RMS) de silagem de cana-de-açúcar contendo níveis crescentes (0, 25, 50 e 75%, na base da matéria natural) de amendoim forrageiro (Arachis pintoi cv. Belmonte), tratadas ou não com Lactobacillus buchneri. Usou-se o esquema fatorial 4×2, no delineamento inteiramente casualizado, com três repetições. Verificou-se efeito de interação níveis de amendoim forrageiro e inoculante para teores de matéria seca, proteína bruta, fibra em detergente neutro e ácido, ácidos orgânicos e etanol, população de bactérias láticas e leveduras, perdas por gases e por efluente e RMS. Houve efeito de níveis de amendoim forrageiro no teor de hemicelulose, nitrogênio insolúvel em detergente ácido, pH e nitrogênio amoniacal. Verificou-se que o aumento de níveis de amendoim forrageiro incrementou teor de proteína e diminuiu teor de fibra, além de reduzir a produção de etanol e de efluente. Recomenda-se inclusão de 40% a 75% de amendoim forrageiro na ensilagem de cana-de-açúcar para melhorar a composição química e o perfil de fermentação. A inoculação com L. buchneri associada ao amendoim forrageiro aumenta a concentração de ácidos antifúngicos na silagem e decresce a população de leveduras e a produção de etanol.

Palavras-chave:
Ácidos orgânicos; Composição química; Etanol; Microrganismos; Recuperação de matéria seca

Introdução

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é um recurso forrageiro tradicionalmente utilizado na alimentação de ruminantes. Para facilitar seu manejo nas propriedades e otimizar o uso da mão-de-obra, recomenda-se sua ensilagem. Entretanto, a presença natural de elevadas populações de leveduras e carboidratos solúveis em silagens de cana-de-açúcar resultam em intensa fermentação alcoólica e perdas de MS(11 Gomes ALM, Bueno AVI, Osmari MP, Machado J, Nussio LG, Jobim CC, et al. Effects of Obligate Heterofermentative Lactic Acid Bacteria Alone or in Combination on the Conservation of Sugarcane Silage. Front Microbiol [Internet]. 2021;12. Available from: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2021.643879
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).

Aditivos bacterianos podem atuar como auxiliares nos processos de fermentação da silagem de cana-de-açúcar. Em particular, Lactobacillus buchneri reduz a população de leveduras e aumenta a estabilidade aeróbia(11 Gomes ALM, Bueno AVI, Osmari MP, Machado J, Nussio LG, Jobim CC, et al. Effects of Obligate Heterofermentative Lactic Acid Bacteria Alone or in Combination on the Conservation of Sugarcane Silage. Front Microbiol [Internet]. 2021;12. Available from: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2021.643879
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,22 Ávila CLS, Carvalho BF, Pinto JC, Duarte WF, Schwan RF. The use of Lactobacillus species as starter cultures for enhancing the quality of sugar cane silage. J Dairy Sci [Internet]. 2014;97(2):940–51. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030213008485
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) via produção de ácido acético(33 Oude Elferink S, Krooneman J, Gottschal J, Spoelstra SF, Faber F, Driehuis F. Anaerobic Conversion of Lactic Acid to Acetic Acid and 1,2-Propanediol by Lactobacillus buchneri. Appl Environ Microbiol. 2001 Feb 1;67:125–32.,44 Muck RE, Nadeau EMG, McAllister TA, Contreras-Govea FE, Santos MC, Kung L. Silage review: Recent advances and future uses of silage additives. J Dairy Sci [Internet]. 2018;101(5):3980–4000. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030218303229
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). Como alternativa aos aditivos, misturas de leguminosas e gramíneas têm sido avaliadas no momento da ensilagem, com o objetivo de melhorar as características nutricionais e/ou fermentativas da silagem(55 da Silva JS, Ribeiro KG, Pereira OG, Mantovani HC, Cecon PR, Pereira RC, et al. Nutritive value and fermentation quality of palisadegrass and stylo mixed silages. Anim Sci J. 2018 Jan;89(1):72–8.). Arachis pintoi ‘Belmonte’ originou-se de um acesso sem semeadura coletado na região de Belmonte, Bahia, Brasil e foi a primeira cultivar de A. pintoi liberada para propagação vegetativa(66 Paganella M, Valls J. Caracterização morfológica de cultivares e acessos selecionados de Arachis pintoi. Pasturas Trop. 2002;24:22–9.). Recentemente, verificou-se que o amendoim forrageiro melhora o valor nutritivo e o perfil de fermentação de silagens de capim-braquiária(77 Gomes FM, Ribeiro KG, De Souza IA, De Lima Silva J, Agarussi MCN, Da Silva VP, et al. Chemical composition, fermentation profile, microbial population and dry matter recovery of silages from mixtures of palisade grass and forage peanut. Trop Grasslands-Forrajes Trop. 2021;9(1):34–42.).

A cana-de-açúcar tem um processo de fermentação intensivo. A adição de amendoim forrageiro, cultura com menor teor de carboidratos solúveis e maior capacidade tamponante, tem potencial para reduzir a intensidade da fermentação, com diminuição mais lenta do pH do material ensilado, aumentando assim a produção de ácidos orgânicos com efeito antifúngico e minimizando a produção de etanol.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição química, o perfil de fermentação, a população de microrganismos e a recuperação de matéria seca (RMS) da silagem de cana-de-açúcar com níveis crescentes de amendoim forrageiro (0%, 25%, 50% e 75%, com base na matéria natural), com e sem a inclusão de L. buchneri.

Material e Métodos

O ensaio foi realizado em duas áreas (área 1 e área 2) no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. O amendoim forrageiro (Arachis pintoi ‘Belmonte’) foi colhido no mesmo dia da cana-de-açúcar ‘RB 76-5418’. Ambas as forrageiras estavam estabelecidas e receberam manejo adequado para cada espécie em áreas separadas.

O solo da área 1 com cana-de-açúcar foi classificado como Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico(88 Santos HG, Jacomine PKT, Anjos LHC, Oliveira VA, Lumbreras JF, Coelho MR, et al. Sistema Brasileiro de Classificação de Solos. Brasília: Embrapa; 2018.). A cana-de-açúcar recebia adubação orgânica com esterco bovino seco, com dose desconhecida. O solo da área 2 com amendoim forrageiro foi classificado como Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico, de acordo com a taxonomia do solo(88 Santos HG, Jacomine PKT, Anjos LHC, Oliveira VA, Lumbreras JF, Coelho MR, et al. Sistema Brasileiro de Classificação de Solos. Brasília: Embrapa; 2018.). O amendoim forrageiro foi implantado aproximadamente 10 anos antes do estudo e foi eventualmente utilizado para a produção de silagens experimentais, com manejo de adubação desconhecido e sem pastejo. Foi realizado um esquema fatorial (4 × 2) com delineamento inteiramente casualizado e três repetições. Os tratamentos consistiram de cana-de-açúcar ensilada com quatro níveis de amendoim forrageiro (0%, 25%, 50% e 75%, base de matéria fresca), com ou sem adição do inoculante microbiano L. buchneri NCIMB 40788 (Silomax Cana, 2,5 × 1010 UFC/g, Matsuda, Brasil).

A cana-de-açúcar foi colhida manualmente e o amendoim forrageiro foi colhido no início do florescimento com roçadeira de lâmina de aço (STIHL®), ambos a uma altura de 5 cm acima do nível do solo. Ambas as forragens foram colhidas no mesmo dia e trituradas em máquina ensiladora estacionária (JF 60, Maxxium, São Paulo, Brasil) ajustada para obter um tamanho médio de partícula de 1 a 2 cm. A forragem foi submetida ao tratamento com o inoculante. Para cada tonelada de material natural foram aplicados cinco gramas de inoculante e diluídos em 1 L de água para aplicação, seguindo as recomendações do fabricante, com um pulverizador costal com capacidade de 5 L. No material não inoculado, foi aplicada a mesma quantidade de água usada para diluir o inoculante.

A forragem foi ensilada em baldes plásticos com capacidade de 20 L, e a compactação foi realizada gerando uma densidade média de 695 kg/m3. Os topos dos baldes continham uma válvula de Bunsen para permitir o escape dos gases de fermentação. Um saco de algodão contendo 4 kg de areia foi colocado no fundo de cada balde para permitir a estimativa da perda por efluente. Após a ensilagem, os silos foram armazenados por 60 dias. Posteriormente, as perdas de gases e efluente e as perdas totais de matéria seca foram calculadas de acordo com Jobim et al.(99 Jobim C, Nussio L, Reis R, Schmidt P. Avanços metodológicos na avaliação da qualidade da forragem conservada. Rev Bras Zootec J Anim Sci - REV BRAS ZOOTECN. 2007 Jul 1;36.)

Os grupos microbianos foram enumerados a partir de 25 g de cada amostra, aos quais foram adicionados 225 mL de solução salina tamponada com fosfato para obter uma diluição de 10-1(10). Diluições sucessivas foram realizadas objetivando-se variações de 10-3 a 10-7 para detecção de bactérias do ácido lático (LAB), 10-2 a 10-6 para enterobactérias e 10-1 e 10-5 para fungos filamentosos + leveduras, em amostras de forragem antes da ensilagem. Para amostras de silagens, diluições de 10-2 a 10-6 foram preparadas para LAB e diluições de 10-2 a 10-6 foram obtidas para enterobactérias, fungos filamentosos e leveduras.

Os meios de cultura seletivos em placas de Petri foram o MRS agar® (Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) para LAB, com incubação por 48 h a 37°C, e Violet Red Bile (VRBGA; Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) para enterobactérias , incubados por 24 h a 37°C, ambos utilizando a técnica pour plate. Para fungos e leveduras, utilizou-se o sistema Petrifilm (3M Microbiology Products, St. Paul, MN, EUA) após incubação por três e cinco dias a 25°C respectivamente. Foram consideradas passiveis de contagem as placas com valores entre 30 e 300 unidades formadoras de colônias (UFC). Para determinar os valores de pH, foram coletados 25 g de silagem de cada silo e adicionados 100 mL de água destilada. Após repouso por 1 h, o pH foi determinado utilizando um potenciômetro (Tecnal, São Paulo, Brasil).

Para determinação do teor de ácidos orgânicos, preparou-se um extrato aquoso utilizando 20 g de material fresco, diluído em água deionizada (1:10) e homogeneizado por 30 s em liquidificador industrial. Após homogeneização, a mistura foi filtrada em quatro camadas de gaze. Uma alíquota de 20 mL deste material filtrado foi centrifugada a 25.000 g × por 25 min a -20°C(1111 Filya I, Muck RE, Contreras-Govea FE. Inoculant Effects on Alfalfa Silage: Fermentation Products and Nutritive Value. J Dairy Sci [Internet]. 2007;90(11):5108–14. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002203020771980X
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) para quantificar os ácidos orgânicos de acordo com Siegfried et al.(1212 Siegfried V, Ruckermann H, Stumpf G, Siegfried B, Ruckemann H, Siegfried R, et al. Method for the determination of organic acids in silage by high performance liquid chromatography. Landwirtsch Forsch. [Internet]. 1984;37(3-4):298-304. Available from: https://www.scienceopen.com/document?vid=12545918-f45c-4b26-ad06-72577b416f09
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). Os ácidos orgânicos utilizados para a curva de calibração padrão foram ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e ácido lático, todos na concentração inicial de 10 mmol/L, exceto o ácido acético, que teve concentração inicial de 20 mmol/L. As amostras foram analisadas em um cromatógrafo duplo Ultimate 3000 Dual Chromatograph (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) acoplado a um detector de índice de refração Shodex RI-101 (Showa Denko; Kawasaki, Kanagawa, Japão) a 45°C e equipado com um detector de troca iônica 300 × 7,8 mm Rezex ROA (Phenomenex; Torrance, CA, EUA) mantida a 45°C.Afase móvel utilizada era 4,2 mmol/L de ácido sulfúrico (H2SO4) e 0,35 mmol/L de ácido etilenodiaminotetracético isento de sódio, a uma taxa de fluxo de 0,7 mL/min.

Para determinar a composição química das silagens, foram coletadas aproximadamente 400 g de amostras de cada silo, pré-secas em estufa com ventilação forçada a 55°C até atingir peso constante e, em seguida, moídas em moinho de facas “Willey”, com peneira de 1 mm. As amostras foram submetidas à análise de MS(1313 AOAC. Official methods of analysis of AOAC International. Gaithersburg, Maryland: AOAC International; 2005.) seguindo o método 930.15; a proteína bruta (PB) foi avaliada pela determinação do nitrogênio total pelo método de Kjeldahl(1313 AOAC. Official methods of analysis of AOAC International. Gaithersburg, Maryland: AOAC International; 2005.) segundo o método 976.05; fibra em detergente neutro corrigida para proteína (FDNp)(1414 Van Soest PJ, Robertson JB, Lewis BA. Methods for Dietary Fiber, Neutral Detergent Fiber, and Nonstarch Polysaccharides in Relation to Animal Nutrition. J Dairy Sci [Internet]. 1991 Oct 1;74(10):3583–97. Available from: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2
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) e fibra em detergente ácido (FDA)(1313 AOAC. Official methods of analysis of AOAC International. Gaithersburg, Maryland: AOAC International; 2005.) foram obtidas pelo método 973.18; e foi avaliado o nitrogênio insolúvel em detergente ácido (NIDA)(1515 Licitra G, Hernandez TM, Van Soest PJ. Standardization of procedures for nitrogen fractionation of ruminant feeds. Anim Feed Sci Technol [Internet]. 1996;57(4):347–58. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0377840195008373
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). Os carboidratos solúveis em água foram extraídos em etanol 80%, conforme metodologia descrita por Silva e Queiroz(1616 Silva DJ, Queiroz AC. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. 3th ed. Viçosa: UFV; 2002. 235 p.), e o teor de nitrogênio amoniacal (N-NH3, %NT) foi determinado de acordo com Bolsen et al.(1717 Bolsen KK, Lin C, Brent BE, Feyerherm AM, Urban JE, Aimutis WR. Effect of Silage Additives on the Microbial Succession and Fermentation Process of Alfalfa and Corn Silages. J Dairy Sci. 1992;75(11):3066–83.)

A Tabela 1 mostra a composição química e as populações microbianas em forragens contendo misturas de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro, sem o inoculante microbiano, antes da ensilagem.

Tabela 1
Composição química (%MS) e populações microbianas (UFC/g) em misturas de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro, antes da ensilagem

Os dados foram avaliados por análise de variância, sendo as médias dos fatores quantitativos submetidas a análises de regressão e as médias dos fatores qualitativos comparadas pelo teste F, a 5% de probabilidade de erro tipo I, utilizando o programa estatístico SAEG 9.1. Para os fatores quantitativos, os modelos foram escolhidos com base na significância dos coeficientes de regressão, pelo teste-t, e nos coeficientes de determinação (R2), adotandose um nível de probabilidade de 5%.

Resultados

Com relação à composição química das silagens, a interação entre a proporção de amendoim forrageiro e inoculante microbiano teve efeitos sobre os teores de MS, PB, FDNp e FDA. O nível de amendoim forrageiro influenciou os teores de HEM e NIDA (Tabela 2). Apesar do efeito da proporção de amendoim forrageiro, não foi obtida equação para descrever efetivamente o teor de MS, com média de 19,2%.

Tabela 2
Composição química (%MS) de misturas de silagem de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro, sem (NI) e com (I) L. buchneri, e respectivas equações de regressão

O teor de PB das silagens aumentou linearmente com a inclusão de amendoim forrageiro na cana ensilada, variando de4,26% a 16,4% e de3,90% a 16,1%, semecom inoculante, respectivamente. Houve decréscimo linear no teor de FDNp de silagens de cana-de-açúcar com níveis crescentes de amendoim forrageiro, variando de 55,3% a 49% e de 56,9 a 45,9%, sem e com inoculante, respectivamente.AFDAna silagem não inoculada também apresentou redução linear com o aumento dos níveis de amendoim forrageiro. Na presença de inoculante, um modelo quadrático ajustou-se aos dados de FDA, com teor mínimo de FDA de 30,3% para 54,5% de amendoim forrageiro na silagem.

Os teores de hemicelulose, embora afetados pelos níveis de amendoim forrageiro, não se ajustaram a nenhuma equação de regressão, com valor médio de 18,0%. O teor de NIDA apresentou comportamento quadrático em função do aumento dos níveis de amendoim forrageiro, com teor máximo de 17,2%, para 62,9% de amendoim forrageiro na mistura.

O pH e o teor de nitrogênio amoniacal (N-NH3 %NT) foram influenciados pelos níveis de amendoim forrageiro. Houve efeito da interação entre nível de amendoim forrageiro e inoculante sobre as concentrações de ácidos lático, acético, propiônico, butírico e etanol (Tabela 3).

Tabela3
Características de perfil fermentativo de misturas de silagens de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro, sem (NI) e com (I) L. buchneri, e respectivas equações de regressão

Os valores de pH apresentaram comportamento quadrático, com valor mínimo de 3,41, com 13,1% de amendoim forrageiro na silagem. O teor de N-NH3 %NT também apresentou comportamento quadrático, com valor mínimo de 4,10%, obtido com a adição de 40,3% de amendoim forrageiro. Os modelos de regressão não se ajustaram aos teores de ácido lático, cuja média foi 9,37% sem inoculante. Com inoculante, houve aumento linear com o acréscimo dos níveis de amendoim forrageiro.

Os teores de ácido acético e propiônico na silagem não inoculada foram descritos por função quadrática, com valores mínimos de 5,98% de ácido acético, com 54,6% de amendoim forrageiro, e 0,57% de ácido propiônico, com 39,2% de amendoim forrageiro. Na presença do inoculante, o comportamento foi linear para ambos os ácidos, com teores variando de 4,32% a 8,02%, para ácido acético, e de 0,53% a 0,75%, para ácido propiônico, com níveis crescentes de amendoim forrageiro.

O teor de ácido butírico apresentou tendência linear na ausência do inoculante, variando de 0,03% a 0,06%. Com o uso do inoculante, o teor de ácido butírico apresentou efeito quadrático, com teor mínimo de 0,02% na silagem de cana-de-açúcar com 15,8% de amendoim forrageiro. O etanol diminuiu linearmente, independente do uso do inoculante, variando de 5,35% a 2,71% e de 5,22% a 2,35% para níveis de 0% e 75% de amendoim forrageiro na silagem, respectivamente. Houve efeito de interação do nível de amendoim forrageiro e do inoculante microbiano nas populações de BALe leveduras (Tabela 4). Não houve efeito dos tratamentos sobre as populações de fungos filamentosos.

Tabela 4
Populações de microrganismos de misturas de silagens de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro, sem (NI) e com (I) L. buchneri, e respectivas equações de regressão

Um modelo quadrático ajustou-se ao crescimento de BAL, obtendo população mínima de 6,7 UFC/g, com 28,6% de amendoim forrageiro, sem inoculante microbiano, e 6,5 UFC/g com 36,8% de amendoim forrageiro, com inoculante. Um modelo de raiz quadrática ajustou-se ao crescimento populacional de leveduras, com populações variando de 3,95 a 3,30 UFC/g e de 4,32 a 3,01 UFC/g, para silagem de cana-deaçúcar com 0% a 75% de amendoim forrageiro, sem e com inoculante microbiano, respectivamente. As populações de fungos filamentosos não foram afetadas pelos tratamentos, com valor médio de 2,56 UFC/g. Detectamos efeitos da interação entre o nível de amendoim forrageiro e o inoculante nas perdas por gases e efluente e RMS (Tabela 5).

Tabela 5
Perdas por gases e efluentes e recuperação de matéria seca de misturas de silagens de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro, sem (NI) e com (I) L. buchneri, e respectivas equações de regressão

A produção de efluente diminuiu linearmente com o aumento dos níveis de amendoim forrageiro, de 97,2 para 14,2 kg/t MN e 96,1 para 1,72 kg/t MN, sem e com inoculante, respectivamente. As perdas por gases, sem e com L. buchneri, apresentaram comportamento quadrático. Sem inoculante, o valor mínimo foi de 2,30%, para 50,5% de amendoim forrageiro na silagem; com o uso de inoculante, o valor mínimo foi de 2,94%, para 58,1% de amendoim forrageiro. As equações de regressão não foram adequadamente ajustadas aos valores de RMS obtidos sem o inoculante microbiano. Com o inoculante, os valores de RMS apresentaram tendência linear, variando de 83,8% a 96,0%, com 0% a 75% de amendoim forrageiro na silagem de cana-de-açúcar, respectivamente.

Discussão

Os baixos teores de MS obtidos nas silagens foram relacionados aos baixos teores de MS obtidos para cana-de-açúcar e amendoim forrageiro antes da ensilagem (Tabela 1). A relação linear entre o nível de amendoim forrageiro e o teor de PB pode ser explicada pelo alto teor desse nutriente na leguminosa, como observado por Gomes et al.(1818 Gomes F, Ribeiro K, de Souza IA, Silva J, Agarussi M, Silva V, et al. Chemical composition, fermentation profile, microbial population and dry matter recovery of silages from mixtures of palisade grass and forage peanut. Trop Grasslands-Forrajes Trop. 2021 Jan 30;9:34–42.) Assim, o teor de proteína da silagem de cana-de-açúcar pode ser melhorado pela adição de amendoim forrageiro, com aumento de até 4,12 vezes para um teor de leguminosa de 75%, o que é nutricionalmente favorável para ruminantes. Gomes et al.(1818 Gomes F, Ribeiro K, de Souza IA, Silva J, Agarussi M, Silva V, et al. Chemical composition, fermentation profile, microbial population and dry matter recovery of silages from mixtures of palisade grass and forage peanut. Trop Grasslands-Forrajes Trop. 2021 Jan 30;9:34–42.) observaram aumento do teor de PB em até 2,4 vezes ao ensilar Urochloa brizantha ‘Marandu’ com amendoim forrageiro compondo 75% da matéria natural.

À medida que os teores de amendoim forrageiro na silagem aumentaram, também foram verificadas reduções nos teores de FDNp e FDAna MS das silagens (Tabela 2). Quando a fermentação indesejável é frequente, como a fermentação alcoólica em cana-de-açúcar, o teor de fibras aumenta na MS da silagem à medida que os carboidratos solúveis diminuem(11 Gomes ALM, Bueno AVI, Osmari MP, Machado J, Nussio LG, Jobim CC, et al. Effects of Obligate Heterofermentative Lactic Acid Bacteria Alone or in Combination on the Conservation of Sugarcane Silage. Front Microbiol [Internet]. 2021;12. Available from: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2021.643879
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), resultando em perdas por efluente(2121 Jesus DLS, Rigueira JPS, Monção FP, Alves WS, Moura MMA, Sales ECJ, et al. Nutritive value of sugarcane silages added with increasing levels of acetic acid. Semin Agrar. 2019;40(5):2387–96.). Além disso, a alta proporção de FDN indigestível na cana-de-açúcar dificulta a solubilização da parede celular durante a fermentação no silo e no rúmen(1919 Daniel J, Jacovaci F, Junges D, Santos M, Lima J, Anjos I, et al. Fibre digestibility and its relationships with chemical and morphological traits in thirty-two sugarcane varieties. Grass Forage Sci. 2016;72.). Portanto, silagens com menores teores de FDN podem proporcionar maior digestibilidade da fibra e, consequentemente, reduzir o efeito limitante no consumo de MS.

O valor de pH obtido para silagem de cana-de-açúcar exclusiva (3,44) (Tabela 3) foi semelhante aos valores relatados por Cardoso et al.(2020 Cardoso LL, Ribeiro KG, Marcondes MI, Pereira OG, Weiß K. Chemical composition and production of ethanol and other volatile organic compounds in sugarcane silage treated with chemical and microbial additives. Anim Prod Sci [Internet]. 2019;59(4):721–8. Available from: https://doi.org/10.1071/AN16204
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) e Jesus et al.(2121 Jesus DLS, Rigueira JPS, Monção FP, Alves WS, Moura MMA, Sales ECJ, et al. Nutritive value of sugarcane silages added with increasing levels of acetic acid. Semin Agrar. 2019;40(5):2387–96.) de 3,41 e 3,39, respectivamente, e indicou uma boa qualidade de fermentação das silagens, principalmente devido aos teores relativamente baixos de ácidos butírico, acético e propiônico nas silagens inoculadas. As silagens de cana-de-açúcar com adição de leguminosas geralmente apresentam valores de pH mais elevados, como observado por Pereira et al.(2222 Pereira DS, Lana R de P, Carmo DL do, Costa YKS da. Chemical composition and fermentative losses of mixed sugarcane and pigeon pea silage. Acta Sci Anim Sci [Internet]. 2019;41(1):e43709. Available from: https://periodicos.uem.br/ojs/index.php/ActaSciAnimSci/article/view/43709
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) em análises de silagens mistas de cana-de-açúcar e guandu, que também foram ajustados por equação quadrática.

As leguminosas têm maior capacidade tamponante devido à presença de cátions (K+, Ca2+ e Mg2+) que são neutralizados quando entram em contato com ácidos orgânicos, evitando uma redução acentuada do pH durante o processo de fermentação(2323 Pirhofer-Walzl K, Søegaard K, Jensen HH, Eriksen J, Sanderson MA, Rasmussen J, et al. Forage herbs improve mineral composition of grassland herbage. Grass Forage Sci. 2011;66(3):415–23.), o que poderia explicar os maiores valores de pH na silagem com maior proporção de amendoim forrageiro, característica de silagens de espécies forrageiras da família Poaceae. Geralmente, as silagens inoculadas com algumas cepas de L. buchneri apresentam valores de pH levemente elevados devido à degradação do ácido lático em ácido acético(2424 Driehuis F, Elferink SJ, Spoelstra SF. Anaerobic lactic acid degradation during ensilage of whole crop maize inoculated with Lactobacillus buchneri inhibits yeast growth and improves aerobic stability. J Appl Microbiol. 1999 Oct;87(4):583–94.,2525 Kung Jr L, Stokes MR, Lin CJ. Silage Additives, In Silage Science and Technology. Am Soc Agron. 2003 Jan 1;305–60.). No entanto, em nosso estudo, o pH não foi afetado pelo inoculante.

Todos os valores médios de N-NH3, independentemente do uso de inoculante e adição de amendoim forrageiro, permaneceram abaixo do limite de 10% recomendado por Kung Jr. et al.(2626 Kung Jr L, Shaver RD, Grant RJ, Schmidt RJ. Silage review : Interpretation of chemical , microbial , and organoleptic components of silages 1. J Dairy Sci [Internet]. 2018;101(5):4020–33. Available from: http://dx.doi.org/10.3168/jds.2017-13909
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) para silagem de boa qualidade, indicando baixa atividade das bactérias clostrídios, o que resulta em proteólise e produção de ácido butírico. Como resultado, as concentrações de ácido butírico também foram mínimas (Tabela 3). A atividade clostridial é um dos principais indicadores de fermentação indesejável, causando perdas de MS e energia, além de afetar o consumo de silagem pelos animais(2727 Borreani G, Tabacco E, Schmidt RJ, Holmes BJ, Muck RE. Silage review: Factors affecting dry matter and quality losses in silages. J Dairy Sci [Internet]. 2018;101(5):3952–79. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030218303205
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). Outros microrganismos, como leveduras e bacilos, também podem produzir pequenas quantidades de ácido butírico(2828 McDonald P, Henderson N, Heron S. The biochemistry of silage [Internet]. Marlow, England: Chalcombe; 1991. p. 340. Available from: http://books.google.com/books?id=oUcjAQAAMAAJ
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).

A concentração de etanol foi negativamente relacionada aos teores de ácido acético e propiônico (Tabela 3) nas silagens inoculadas. Este resultado é interessante e fornece evidências do efeito interativo de L. buchneri e amendoim forrageiro na silagem de cana-de-açúcar ao aumentar a produção de ácido acético, considerando que em silagens de cana-de-açúcar a população de bactérias produtoras de ácido acético tende a ser mínima devido à competição de substrato com leveduras(2121 Jesus DLS, Rigueira JPS, Monção FP, Alves WS, Moura MMA, Sales ECJ, et al. Nutritive value of sugarcane silages added with increasing levels of acetic acid. Semin Agrar. 2019;40(5):2387–96.).

Devido à capacidade tamponante da leguminosa, houve aumento de espécies heterofermentativas, sustentado pelo efeito positivo do inoculante nas concentrações de ácido acético e propiônico, que possuem propriedades antifúngicas e inibem o crescimento de leveduras, segundo Danner et al.(2929 Danner H, Holzer M, Mayrhuber E, Braun R. Acetic acid increases stability of silage under aerobic conditions. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2003 Jan;69(1):562–7. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12514042
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), consequentemente, diminuindo a produção de etanol. Com a redução da atividade das leveduras, o ácido lático também apresentou aumento linear devido à diminuição do seu uso para fermentação alcoólica, de acordo com Pahlow et al.(3030 Pahlow G, Muck R, Driehuis F, Oude Elferink S, Spoelstra SF. Microbiology of Ensiling. In: Silage Science and Technology. 2003. p. 31-93.)

Algumas cepas de L. buchneri não têm a capacidade de reduzir o acetil fosfato a etanol, possivelmente devido à falta da acetaldeído desidrogenase, aumentando assim a concentração de ácido acético como produto final da fermentação(3131 Axelsson L. Lactic acid bacteria: Classification and physiology. In: Salminen S, Von Wright A, editors. Lactic acid bacteria. New York: Marcel Dekker; 2004. p. 1–63.). Embora L. buchneri não produza ácido propiônico, na conversão de ácido lático em ácido acético também é formado 1,2-propanodiol, que pode ser um precursor para a conversão em ácido propiônico e 1-propanol pelo microrganismo epifítico L. diolivorans(3232 Krooneman J, Faber F, Alderkamp AC, Elferink SJHWO, Driehuis F, Cleenwerck I, et al. Lactobacillus diolivorans sp. nov., a 1,2-propanediol-degrading bacterium isolated from aerobically stable maize silage. Int J Syst Evol Microbiol. 2002 Mar;52(Pt 2):639–46.), explicando porque silagens tratadas com L. buchneri podem apresentar aumento do teor de ácido propiônico na silagem(3333 Hafner SD, Howard C, Muck RE, Franco RB, Montes F, Green PG, et al. Emission of volatile organic compounds from silage: Compounds, sources, and implications. Atmos Environ [Internet]. 2013;77:827–39. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1352231013003403
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).

O efeito fungicida do ácido acético e propiônico é devido à sua lipofilicidade. Em um ambiente ácido, esses ácidos podem permear a membrana da célula da levedura; dentro da célula, em pH neutro, ocorre a dissociação e liberação de prótons e contra-íons, acidificando o meio intracelular e afetando a homeostase do pH, a organização lipídica e a função da membrana celular, o que pode levar à morte desses microrganismos(2929 Danner H, Holzer M, Mayrhuber E, Braun R. Acetic acid increases stability of silage under aerobic conditions. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2003 Jan;69(1):562–7. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12514042
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, 3434 Xu X, Williams TC, Divne C, Pretorius IS, Paulsen IT. Evolutionary engineering in Saccharomyces cerevisiae reveals a TRK1-dependent potassium influx mechanism for propionic acid tolerance. Biotechnol Biofuels [Internet]. 2019;12(1):97. Available from: https://doi.org/10.1186/s13068-019-1427-6
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).

Segundo Kung Jr. et al.(2626 Kung Jr L, Shaver RD, Grant RJ, Schmidt RJ. Silage review : Interpretation of chemical , microbial , and organoleptic components of silages 1. J Dairy Sci [Internet]. 2018;101(5):4020–33. Available from: http://dx.doi.org/10.3168/jds.2017-13909
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), em silagem de boa qualidade, as concentrações de ácido lático devem ser de 60-80 g/kg MS, ácido acético de até 30 g/kg MS, ácido propiônico de até 5 g/kg MS, e as concentrações de ácido butírico devem ser inferiores a 5 g/kg MS. Embora os valores médios de ácido butírico no presente estudo estivessem dentro da faixa adequada, valores acima da faixa recomendada foram obtidos para os ácidos acético, lático e propiônico (Tabela 3). Isso pode ser devido às altas concentrações de carboidratos solúveis nessas silagens, resultando em alta produção de compostos orgânicos durante a fermentação (principalmente ácido lático, ácido acético e etanol), que pode corresponder a até 22% da MS das silagens de cana-de-açúcar, segundo Daniel et al.(3535 Daniel JLP, Weiß K, Custódio L, Neto AS, Santos MC, Zopollatto M, et al. Occurrence of volatile organic compounds in sugarcane silages. Vol. v. 185, Animal feed science and technology. Elsevier B.V.; 2013.) Isso difere de outras silagens adotadas na alimentação animal, como a silagem de milho, que geralmente é utilizada como parâmetro para os valores médios de ácidos produzidos.

Um teor de ácido acético acima de 2% na MS é desejável para silagens com alto teor de carboidratos solúveis, como por exemplo a cana-de-açúcar, pois causa menor atividade das leveduras. Isso se soma à baixa quantidade total de CO2 liberada como subproduto da formação do ácido acético em relação à quantidade liberada durante a fermentação alcoólica(11 Gomes ALM, Bueno AVI, Osmari MP, Machado J, Nussio LG, Jobim CC, et al. Effects of Obligate Heterofermentative Lactic Acid Bacteria Alone or in Combination on the Conservation of Sugarcane Silage. Front Microbiol [Internet]. 2021;12. Available from: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2021.643879
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), reduzindo as perdas por gases e melhorando a estabilidade aeróbia após a abertura dos silos.

A adição de amendoim forrageiro atua como uma alternativa para reduzir a atividade das leveduras durante o processo de fermentação na silagem de cana-de-açúcar (Tabela 4), pois os microrganismos são um dos principais problemas na ensilagem dessa cultura(2020 Cardoso LL, Ribeiro KG, Marcondes MI, Pereira OG, Weiß K. Chemical composition and production of ethanol and other volatile organic compounds in sugarcane silage treated with chemical and microbial additives. Anim Prod Sci [Internet]. 2019;59(4):721–8. Available from: https://doi.org/10.1071/AN16204
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). Em todas as silagens deste estudo não foram detectadas enterobactérias, o que pode ser explicado pela acidez do meio. Os silos foram abertos 60 dias após a ensilagem. Segundo Luis e Ramirez(3636 Luis L, M. Ramirez. Evolución de la flora microbiana em ensilaje de king grass. Pastos y Forrajes. 1988;11:249–53.), essas bactérias normalmente se multiplicam até aproximadamente o sétimo dia de fermentação, quando são substituídas por grupos lácticos, que são mais resistentes às reduções de pH.

O teor de MS, o tipo de fermentação e a densidade da silagem (compactação) influenciam na produção de efluente(2121 Jesus DLS, Rigueira JPS, Monção FP, Alves WS, Moura MMA, Sales ECJ, et al. Nutritive value of sugarcane silages added with increasing levels of acetic acid. Semin Agrar. 2019;40(5):2387–96.). Como a densidade (695 kg/m3) foi semelhante entre todos os tratamentos e o teor de MS apresentou pouca variação no momento da ensilagem (±2%), acredita-se que a variação nas perdas por efluente se deva à variação nos microrganismos fermentativos, principalmente as leveduras(3737 Schmidt RJ, Kung LJ. The effects of Lactobacillus buchneri with or without a homolactic bacterium on the fermentation and aerobic stability of corn silages made at different locations. J Dairy Sci. 2010 Apr;93(4):1616–24.).

Segundo Kung Jr. et al.(3838 Kung Jr L, Shaver RD, Grant RJ, Schmidt RJ. Silage review: Interpretation of chemical, microbial, and organoleptic components of silages. J Dairy Sci [Internet]. 2018;101(5):4020–33. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030218303242
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), a massa ensilada deve conter um teor de MS de 30% a 35% para garantir perdas mínimas por efluente e manter o valor nutritivo da silagem, por meio da inibição de microrganismos indesejáveis, como clostrídios. Apesar dos teores de MS de todas as silagens do presente estudo estarem abaixo dessa faixa, a adição de amendoim forrageiro foi suficiente para reduzir as perdas por efluente, reduzindo a lixiviação do material (Tabela 5). As silagens do presente estudo apresentaram menor perda (Tabela 5) do que as silagens de cana-de-açúcar relatadas em outros estudos, embora o teor de MS no momento da ensilagem fosse maior(3939 Moraes RL, Ribeiro KG, Pereira OG, Marcondes MI, Cardoso LL. Silagem de cana-de-açúcar tratada com inoculantes microbianos e suas misturas. Rev Bras Agropecuária Sustentável [Internet]. 2017 Oct 24;7(3):76–83. Available from: https://periodicos.ufv.br/rbas/article/view/2943
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,4040 Silva L, Pereira O, Silva T, Leandro E, Paula R, Santos S, et al. Effects of Lactobacillus buchneri isolated from tropical maize silage on fermentation and aerobic stability of maize and sugarcane silages. Grass Forage Sci. 2018 Apr 23;73.). Portanto, as perdas podem ser consideradas razoáveis para silagens mistas de cana-de-açúcar e amendoim forrageiro.

As perdas por gases estão diretamente relacionadas à atividade de microrganismos heterofermentativos na massa ensilada, principalmente leveduras, onde convertem carboidratos solúveis e ácido lático em ácido acético, etanol, CO2 e calor(2020 Cardoso LL, Ribeiro KG, Marcondes MI, Pereira OG, Weiß K. Chemical composition and production of ethanol and other volatile organic compounds in sugarcane silage treated with chemical and microbial additives. Anim Prod Sci [Internet]. 2019;59(4):721–8. Available from: https://doi.org/10.1071/AN16204
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,4141 Muck RE. Silage microbiology and its control through additives. Rev Bras Zootec. 2010;39:183–91.). Os resultados para as perdas por gases no presente estudo podem ser explicados pelos efeitos sobre a população de leveduras e a redução na produção de etanol, resultando na redução da produção de gases com adição de até 58% de amendoim forrageiro na silagem de cana-de-açúcar. Ren et al.(4242 Ren H, Wang C, Fan W, Zhang B, Li Z, Li D. Effects of formic or acetic acid on the storage quality of mixed air-dried corn stover and cabbage waste, and microbial community analysis. Food Tech. and Biotech. 2018; 56:71–82.) demostraram que a redução das perdas por gases e maior RMS indicam que as fermentações secundárias indesejáveis não foram tão frequentes durante a fermentação, o que é positivo do ponto de vista nutricional, resultando em uma conservação mais adequada do material.

Em alguns estudos, não foram observados efeitos da inoculação com L. buchneri nas perdas e RMS de silagens de cana-de-açúcar(2020 Cardoso LL, Ribeiro KG, Marcondes MI, Pereira OG, Weiß K. Chemical composition and production of ethanol and other volatile organic compounds in sugarcane silage treated with chemical and microbial additives. Anim Prod Sci [Internet]. 2019;59(4):721–8. Available from: https://doi.org/10.1071/AN16204
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,3939 Moraes RL, Ribeiro KG, Pereira OG, Marcondes MI, Cardoso LL. Silagem de cana-de-açúcar tratada com inoculantes microbianos e suas misturas. Rev Bras Agropecuária Sustentável [Internet]. 2017 Oct 24;7(3):76–83. Available from: https://periodicos.ufv.br/rbas/article/view/2943
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), enquanto outros estudos corroboram a eficácia de L. buchneri (11 Gomes ALM, Bueno AVI, Osmari MP, Machado J, Nussio LG, Jobim CC, et al. Effects of Obligate Heterofermentative Lactic Acid Bacteria Alone or in Combination on the Conservation of Sugarcane Silage. Front Microbiol [Internet]. 2021;12. Available from: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2021.643879
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,4040 Silva L, Pereira O, Silva T, Leandro E, Paula R, Santos S, et al. Effects of Lactobacillus buchneri isolated from tropical maize silage on fermentation and aerobic stability of maize and sugarcane silages. Grass Forage Sci. 2018 Apr 23;73.). Esses resultados conflitantes podem ser atribuídos a diferenças entre as linhagens, incluindo diferenças no metabolismo e na capacidade de sobrevivência no ambiente de silagem, mesmo para linhagens da mesma espécie(4343 Santos AO, Ávila CLS, Pinto JC, Carvalho BF, Dias DR, Schwan RF. Fermentative profile and bacterial diversity of corn silages inoculated with new tropical lactic acid bacteria. J Appl Microbiol. 2016 Feb;120(2):266–79.). Portanto, esses resultados indicam que o amendoim forrageiro pode ser incluído em silagens de cana-de-açúcar para reduzir a produção de etanol e as perdas por gases e efluente, com consequente aumento da RMS. Isso proporciona uma estratégia complementar para gerar efeitos associativos com a ação do inoculante heterofermentativo, além de melhorar a RMS da silagem.

Conclusões

A inclusão de 40% a 75% de amendoim forrageiro na ensilagem de cana-de-açúcar melhora a composição química e o perfil de fermentação. A inoculação com L. buchneri associada ao amendoim forrageiro aumenta as concentrações de ácidos antifúngicos na silagem e diminui a população de leveduras e a produção de etanol. Mais estudos, principalmente aqueles focados em dietas animais, melhorariam nossa compreensão dos efeitos benéficos dessa estratégia.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao INCT-CA/CNPq (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia-Ciência Animal/Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pela concessão da bolsa de estudos ao primeiro autor. A pesquisa foi financiada pelo INCT-CA/CNPq. K. Ribeiro e O. Pereira são bolsistas de pesquisa do CNPq.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    15 Ago 2022
  • Data do Fascículo
    2022

Histórico

  • Recebido
    25 Mar 2022
  • Aceito
    01 Jun 2022
  • Publicado
    18 Jul 2022
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