Detecção de um begomovírus em amostras foliares de tomateiro com sondas não-radioativas

Detection of a begomovirus in tomato leaf samples using non-radioactive probes

NOTA

DEFESA FITOSSANITÁRIA

Detecção de um begomovírus em amostras foliares de tomateiro com sondas não-radioativas

Detection of a begomovirus in tomato leaf samples using non-radioactive probes

Flávio Martins Santana^I,1; Alice Kazuko Inoue-Nagata^II; Tatsuya Nagata^III; Simone da Graça Ribeiro^IV; Antônio Carlos de Ávila^V; Leonardo de Britto Giordano^VI

^IPrograma de Pós-graduação em Fitossanidade, Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Embrapa Clima Temperado, CP. 403, 96001-970, Pelotas, RS, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IILaboratório de Biologia Molecular da Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, Brasil

^IIICurso de Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, DF, Brasil

^IVLaboratório de Biologia Molecular da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil

^VLaboratório de Virologia da Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, Brasil

^VILaboratório de Melhoramento Vegetal da Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, Brasil

RESUMO

O aumento na ocorrência de begomoviroses (geminiviroses) em tomateiros, Lycopersicon esculentum Mill., em várias regiões brasileiras, vem causando grandes prejuízos para o agronegócio de tomate, devido à ocorrência do inseto vetor, Bemisia argentifolii (Bemisia tabaci biotipo B). A diagnose é realizada em geral por “polymerase chain reaction” (PCR) ou por hibridização com sondas radioativas. A PCR é um método de alta sensibilidade, porém apresenta a desvantagem da possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos, devido a contaminações, ou falso-negativos causados por inibidores contaminantes da reação, ou pela extrema especificidade dos iniciadores. A hibridização de ácidos nucléicos com sondas radioativas tem o seu uso limitado devido à necessidade de infra-estrutura especial, treinamento de pessoal, riscos para a saúde do manipulador e demanda constante de radioquímicos. O presente trabalho tem por finalidade demonstrar a viabilidade do uso do método de hibridização com sondas não-radioativas para a detecção de um begomovírus de tomateiro do Brasil. A sensibilidade do teste foi alta, obtendo-se detecção de até 0,1fg do DNA homólogo e em extrato bruto foliar diluído até 100 vezes.

Palavras-chave:Lycopersicon esculentum, geminivírus, diagnose, digoxigenina.

ABSTRACT

Major outbreaks of tomato begomoviruses (geminiviruses) in several tomato Lycopersicon esculentum Mill growing in many parts of Brazil have been imposing significant losses upon the tomato agribusiness, due to the introduction of the Bemisia argentifolii (Bemisia tabaci biotype B). Polymerase chain reaction (PCR) and hybridization are generally used for diagnosis. The PCR is a detection method with high sensitivity, however it has the disadvantage of producing false-positives, due to contamination, or false-negatives caused by inhibitors or because of the high primer specifity. The use of nucleic acid hybridization with radio-labelled probes is restricted due to the requirement of special infrastructure and handling experience, the risk for the user’s health and a regular radiochemical element supply. This study is aimed at demonstrating the usefulness of the hybridization method with non-radioactive probes for detection of a tomato begomoviruses in Brazil. The sensitivity of this method was high enabling the detection of 0.1fg of homologous DNA and in crude sap extract diluted up to 100-fold.

Key words:Lycopersicon esculentum, geminivirus, diagnosis, digoxigenin.

O tomateiro, Lycopersicon esculentum Mill., é uma das hortaliças de maior importância no Brasil, tanto para consumo in natura como para o setor agroindustrial. Um dos principais problemas na cadeia de produção de tomate reside na alta incidência de vírus da família Geminiviridae, gênero Begomovírus, constituídos de DNA de fita simples e circular. A ocorrência da doença tem sido generalizada desde o Nordeste ao Sudeste brasileiro, além de demais países sul-americanos, onde perdas de 40% até 100% da produção têm sido relatadas. Os sintomas da doença são amarelecimento de nervuras, rugosidade, diminuição do tamanho das folhas, clorose internerval e mosaico dourado (TAVARES 2002; RIBEIRO et al., 2003). A transmissão desse vírus se dá pela mosca-branca, Bemisia argentifolii Bellows & Perring (SANTOS et al., 2004). A diagnose é, em geral, realizada pela avaliação dos sintomas e por meio de testes de detecção por “polymerase chain reaction” (PCR) e por hibridização com sonda radioativa (SANTANA et al., 2001; NAGATA et al., 2004). Os métodos de hibridização com sonda não-radioativa já vêm sendo utilizados para detecção de begomovírus fora do Brasil (SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 1999). Este trabalho teve como objetivo avaliar o uso do método de detecção por hibridização com sonda marcada com digoxigenina aplicado a um isolado de begomovírus em tomateiro no Brasil.

A sonda não-radioativa foi preparada com o clone contendo o gene completo da capa protéica (pCP) do isolado DF-BR2 de tomate, presente no Distrito Federal, uma possível variante do begomovírus Tomato rugose mosaic vírus - TRMV (INOUE-NAGATA et al., 1999,). A síntese da sonda foi feita utilizando-se o DIG-High prime labeling kit (Roche) seguindo-se as recomendações do fabricante, usando 3mg do DNA amplificado do clone pCP por PCR com os oligonucleotídeos CP1 e CP2 (fragmento de 0,9kb), contendo todo o gene da capa protéica (NAGATA et al., 2004).

A hibridização foi realizada em membranas de náilon (Hybond N+, Amersham Biosciences) com a aplicação de plasmídeos ou de extratos de plantas diluídos em 0,4N NaOH. Após a aplicação, a membrana foi neutralizada com Tris 0,5 M pH 7,5 por cinco minutos, secada a temperatura ambiente e armazenada a 4°C. Um total de 25ng.ml^-1 da sonda marcada com digoxigenina foi utilizada para a hibridização conforme a recomendação do fabricante. A hibridização foi realizada a 68°C, usando-se o tampão de hibridização padrão (5x SSC, N-lauroylsarcosine 0,1%, SDS 0,02%, reagente bloqueador 1% (Roche)) e as lavagens foram realizadas a 68°C, duas vezes com 2x SSC, SDS 0,1% por cinco minutos e duas vezes com 0.5x SSC, SDS 0,1% por 15 minutos.

As membranas foram então bloqueadas por uma hora a temperatura ambiente ou por toda a noite a 10°C em tampão maléico (ácido maléico 100mM, NaCl 150mM pH 7,5) com reagente bloqueador a 1% (reagente bloqueador - Roche). À solução bloqueadora, foi acrescentado anticorpo antidigoxigenina conjugado com fosfatase alcalina (AP-alkaline phosphatase, 150mU.ml^-1) e incubado por uma hora a temperatura ambiente ou por toda a noite a 10°C. Três lavagens foram realizadas com tampão maléico acrescido de 0,3% de tween-20 por 15 minutos e a revelação foi feita com a adição de NBT (nitro blue tetrazolium) e BCIP (5-bromo-4-chloro-3 indolyl phosphate) em tampão de revelação (Tris-HCl 0,1M, NaCl 0,1M, MgCl₂ 50mM, pH 9,5).

Um processo alternativo de revelação por quimioluminescência foi avaliado. O bloqueamento foi feito por uma hora a temperatura ambiente ou por toda a noite a 10°C em tampão fosfato salino (PBS) com reagente bloqueador a 1%. À solução bloqueadora, foi acrescentado anticorpo antidigoxigenina conjugado com peroxidase (HRP-horseraddish peroxidase, 75mU.ml^-1), sendo incubado por uma hora a temperatura ambiente ou por toda a noite a 10°C. Três lavagens foram realizadas com PBS – Tween-20 (0,05%) por 15 minutos. A revelação foi feita com a adição de substrato quimioluminescente (ECL detection kit, Amersham), conforme as recomendações do fabricante. O excesso da solução contendo substrato foi removido e as membranas foram expostas ao filme de raios-X (Kodak X-OMAT) por cinco minutos (curta exposição) ou por toda a noite (longa exposição).

Para se verificar a possibilidade de utilização deste método em testes de rotina, foram avaliadas folhas de tomateiro coletadas no campo. Foram avaliados, por colorimetria e quimioluminescência, folhas com sintomas e sem sintomas de begomovírus.

O DNA homólogo ao do TRMV, DF-BR2 foi aplicado na membrana em várias concentrações para se avaliar a sensibilidade do método de detecção (Figura 1A). De 1ng a 0,1fg de DNA purificado homólogo aplicado nas membranas, a reação foi observada em todas as concentrações. O resultado foi semelhante tanto por colorimetria (Dig-AP) como por quimioluminescência (Dig-HRP1), demonstrando a alta sensibilidade do teste. Uma exposição mais longa da membrana ao filme de raios-X permitiu uma maior nitidez da reação (Dig-HRP2). O controle negativo utilizado, DNA purificado de bacteriófago lambda, não apresentou qualquer reação com a sonda (Figura 1A), demonstrando a especificidade do teste.

Extratos de folhas de tomate infectadas com o isolado DF-BR2 ou plantas sadias foram aplicados em membranas de náilon nas diluições 10^-1 a 10^-4. As membranas foram hibridizadas e a reação positiva foi observada nas diluições 10^-1 e 10^-2, tanto por colorimetria (Dig-AP), como por quimioluminescência (Dig-HRP) (Figura 1B). Não foi observada reação da sonda com o extrato de planta sadia, o que mostra que, por este método, pode-se detectar plantas infectadas em diluições de dez a 100 vezes.

Das folhas provenientes do campo (Figura 1C), com sintomas (1a, 2a, 3a, 4a, 1b e 2b) ou sem sintomas (3b, 4b, 1c e 2c), os resultados por colorimetria (Dig-AP) e quimioluminescência (Dig-HRP1, Dig-HRP2) foram os mesmos. As plantas com sintomas de begomovírus reagiram positivamente com a sonda específica. Das quatro plantas sem sintomas, uma mostrou reação positiva no teste (1c), indicando que o método pode identificar plantas infectadas, mesmo que essas não apresentem sintomas aparentes. O controle positivo (3c) mostrou reação similar às demais plantas infectadas e o controle negativo (4c) não reagiu com a sonda, conforme esperado.

A hibridização com sondas radioativas é um método altamente específico e de amplo uso em detecção, porém esbarra na necessidade de uma infra-estrutura adequada, de treinamento de pessoal e no aumento de riscos para a saúde dos usuários. Como alternativa à hibridização por sondas radioativas, surgiram os reagentes para a confecção de sonda não-radioativa, com o uso de digoxigenina, biotina etc.

O método avaliado neste trabalho utilizou sondas marcadas com digoxigenina, que mostraram eficiência e praticidade. A sensibilidade foi bastante alta, chegando à escala de fentogramas, quando hibridizado com DNA homólogo. A grande vantagem deste método é a longevidade da sonda, que pode ser usada por várias vezes e por pelo menos um ano, sem a perda da atividade, segundo informações do fabricante. O método vem sendo empregado rotineiramente na Embrapa Hortaliças para detecção de DF-BR2, com uma modificação em relação ao método descrito: o protocolo de detecção utilizado para anticorpo conjugado com fosfatase alcalina está sendo realizado com o tampão PBS-T. Esta modificação foi feita devido à baixa longevidade do tampão maléico, que apresenta crescimento microbiano com muita facilidade, mesmo após autoclavagem.

O método de hibridação com sonda não-radioativa viabiliza a detecção de um begomovírus em tomateiro, em um grande número de amostras, de modo eficiente e sensível. Comparando-se os níveis de detecção pela sonda com o DNA purificado e com extrato da planta infectada, poder-se-ia inferir que, com este método, é possível diagnosticar plantas infectadas com DF-BR2 até a escala de fentogramas, o que, para este trabalho, correspondeu a uma diluição do extrato da planta infectada em até 100 vezes. Para confirmação desses valores, poder-se-ia realizar a quantificação do vírus na planta por PCR em tempo real.

Recebido para publicação 05.10.05

Aprovado em 26.07.06

• Inoue-Nagata, A.K. et al. Expression of the coat protein of tomato infecting geminivirus in Escherichia coli for serological studies. Virus Reviews & Research, v.4, p.151 1999. (Resumo).
• NAGATA, T. et al. Print-capture PCR for detection of tomato geminiviruses from plants and whiteflies. Fitopatologia Brasileira, v.29, p.91-93, 2004.
• Ribeiro, S.G. et al. Distribution and genetic diversity of tomato-Infecting begomoviruses in Brazil. Archives of Virology, v.148, p.281-295, 2003.
• SÁNCHEZ-CAMPOS, S., et al. Displacement of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)-Sr by TYLCV-Is in tomato epidemics in Spain. Phytopathology, v.89, p.1038-1043, 1999.
• SANTANA, F.M. et al. Sources of resistance in Lycopersicon spp. to a bipartite whitefly-transmitted geminivirus from Brazil. Euphytica, v.122, p.45-51, 2001.
• SANTOS, C.D.G. et al. Espécies vegetais hospedeiras de begomovírus isolados de tomateiro em Goiás e no Distrito Federal. Fitopatologia Brasileira, v.29, p.450-455, 2004.
• TAVARES, C.A.M. Perspectivas econômicas da tomaticultura frente aos problemas causados pelo geminivírus. Biológico, v.64, p.157-158, 2002.

1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Jan 2007
• Data do Fascículo
  Fev 2007

Histórico

• Aceito
  26 Jul 2006
• Recebido
  05 Out 2005