Immunogenic and antigenic aspects from five Toxoplasma gondii strains inoculated in cats

cr Ciência Rural Cienc. Rural 0103-8478 1678-4596 Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brazil The biology of Toxoplasma gondii demonstrate that cats are the complete host responsable for the dissemination of this parasites. Two domestic cats were immunised with Toxoplasma gondii strains VPS (human), LIV-IV and LIV-V (porcine), CPL (caprine) and CN (feline). Live tachyzoites were utilized in intravenous inoculation of 2x10(7) (first inoculum) and 4x10(7) (second inoculum - 35 days later), except for strain VPS, where one cat died 10 days after the first inoculation and another showed symptoms of acute toxoplasmosis. In all other strains, no clinical signs were detected during 6 months of observation. The antibody response after immunization was monitored by indirect immunofluorescence (IF) test by the use of anti-cat IgG conjugate. The antibody titers obtained at the 20th day varied from 1:1,024 to 1:4,096 and from 1:1,024 to 1:8,000 at the 40th day. Only the VPS strain attained titers of 1:16,000 at the 30th day of immunization. Homologous and heterologos titers were equivalem without any difference among the strain. When the immune sera were adsorbed with live tachyzoites, a reduction in the antibody titers was demonstrated both in homologous and heterologous levels. These results suggest that although dijferences in virulence for cats are evident among the strains. The surface antigens are commom among the T. gondii strains on the basis of IF antibody level. The results also demonstrated that apparently there is no correlation between virulence and serological characteristics of the studied strains of Toxoplasma gondii. However the importance of the IF test in the laboratorial diagnosis of Toxoplasmosis is reinforced. COMPORTAMENTO IMUNOLÓGICO E ANTIGÊNICO DE CINCO AMOSTRAS DE Toxoplasma gondii INOCULADAS EM GATOS1 IMMUNOGENIC AND ANTIGENIC ASPECTS FROM FIVE TOXOPLASMA GONDII STRAINS INOCULATED IN CATS Italmar Teodorico Navarro2 Odilon Vidotto2 Andréa Carlos Bekner da Silva3 Regina Mitsuka3 José Vitor Jankevicius4 Paula Namie Shida5 José de Angelis Cortês6 RESUMO A biologia do Toxoplasma gondii demonstra que o gato é o hospedeiro completo, responsável pela disseminação do parasito. Assim, dois gatos domésticos foram imunizados com cada uma das amostras, VPS (humano), LIV-IV e LIV-V (suíno), CPL (caprino) e CN (felino) de T. gondii. Foram utilizados taquizoítas vivos em inóculos endovenosos de 2x106 (1° inóculo} e 4x107 (2° inóculo - 35 dias após), exceto a amostra VPS, onde 1 gato morreu no 10° dia com sinais clínicos agudos da doença, nas outras amostras, nenhum sinal clínico foi constatado durante os 6 meses de observação. O nível de anticorpos na imunização foi acompanhado através da reação de imunofluorescência indireta (IFI) com conjugado anti-IgG de felino. Os títulos de anticorpos obtidos no 20° dia variaram de 1:1.024 a 1:4.096 e de 1:1.024 a 1:8.000 no 40° dia. Somente a amostra VPS expressou títulos de 1:16.000 no 30° dia da imunização. Títulos homólogos e heterólogos foram equivalentes sem nenhuma diferença entre as amostras. Quando soros imunes foram adsorvidos com taquizoítas vivos de cada amostra, a redução nos títulos de anticorpos foi demonstrada em ambos homólogos e heterólogos. Esses resultados sugerem que, embora diferente em virulência para gatos, a superfície antigênica é comum entre as amostras do T. gondii, com base no nível de anticorpo demonstrado pela IFI. Esses resultados também demonstram que, aparentemente, não há correlação entre virulência e as características sorológicas das amostras estudadas no T. gondii. Entretanto, a importância do teste IFI em diagnóstico laboratorial é reforçada. Plavras-chave: Toxoplasma gondii, antígeno, gatos. SUMMARY The biology of Toxoplasma gondii demonstrate that cats are the complete host responsable for the dissemination of this parasites. Two domestic cats were immunised with Toxoplasma gondii strains VPS (human), LIV-IV and LIV-V (porcine), CPL (caprine) and CN (feline). Live tachyzoites were utilized in intravenous inoculation of 2x107 (first inoculum) and 4x107 (second inoculum - 35 days later), except for strain VPS, where one cat died 10 days after the first inoculation and another showed symptoms of acute toxoplasmosis. In all other strains, no clinical signs were detected during 6 months of observation. The antibody response after immunization was monitored by indirect immunofluorescence (IF) test by the use of anti-cat IgG conjugate. The antibody titers obtained at the 20th day varied from 1:1,024 to 1:4,096 and from 1:1,024 to 1:8,000 at the 40th day. Only the VPS strain attained titers of 1:16,000 at the 30th day of immunization. Homologous and heterologos titers were equivalem without any difference among the strain. When the immune sera were adsorbed with live tachyzoites, a reduction in the antibody titers was demonstrated both in homologous and heterologous levels. These results suggest that although dijferences in virulence for cats are evident among the strains. The surface antigens are commom among the T. gondii strains on the basis of IF antibody level. The results also demonstrated that apparently there is no correlation between virulence and serological characteristics of the studied strains of Toxoplasma gondii. However the importance of the IF test in the laboratorial diagnosis of Toxoplasmosis is reinforced. Key words: Toxoplasma gondii, antigenic, cat. INTRODUÇÃO A toxoplasmose, zoonose decorrente da infecção pelo Toxoplasma gondii (NICOLLE & MANCEAUX, 1909), tem sido considerada por APTL (1973), como a parasitose mais freqüente na espécie humana e provavelmente entre todos os animais homeotérmicos. De natureza cosmopolita, apresenta uma prevalência global média, a julgar pelas enquetes sorológicas, da ordem de 25% da população humana adulta do mundo. Na maioria das vezes, o Toxoplasma gondii parasita o hospedeiro sem produzir sintomas e a exposição ao agente infeccioso é suficiente para garantir, na maioria dos casos, sua instalação e persistência no organismo parasitado, face à capacidade que apresenta de formar cistos nos diversos tecidos (Mc KINNEY, 1973; JONES, 1973), com conseqüente indução da imunidade contra a reinfecção (REMINGTON & KRAHENBUHL, 1982). Mas, apesar da elevada freqüência de infecção inaparente, essa zoonose pode manifestar-se como doença sistêmica severa, tal é o caso da forma congênita (REMINGTON, 1968; DESMONDS & COUVREUR, 1974), ou da forma adquirida em pacientes imunodeprimidos (FRENKEL et al. 1975; RUSKIN & REMINGTON, 1976). Desta forma, sua importância no âmbito da saúde pública, reside no fato de representar uma apreciável causa de morbidade neonatal, com ocorrência de lesões oculares, de intensidade variável, e alterações cerebrais graves (FRENKEL, 1973). Na natureza, inúmeras espécies de mamíferos e aves são comumente acometidas pela toxoplasmose. Os felídeos, contudo, são considerados como hospedeiros preferenciais e principais fontes de infecção para os herbívoros e, em menor expressão, para seus predadores. Epidemiologicamente, o contato com solo contaminado com fezes de gatos infectados é mais importante que o contato direto com os gatos. Assim, os ovinos, os caprinos e outros herbívoros, tornam-se infectados pastando em áreas contaminadas. A infecção destes hospedeiros, depende, não apenas das condições ambientais, mas principalmente da densidade populacional de gatos da área, que irá determinar o grau de contaminação do solo com oocistos do parasita que os hospedeiros suscetíveis podem ingerir (RUIZ & FRENKEL, 1980). Devido ao importante papel desempenhado pelo gato na epidemiologia da toxoplasmose, tem-se realizado numerosos estudos sobre a infecção dessa espécie animal, buscando associar a existência de anticorpos circulantes com a presença de oocistos nas fezes. Tais observações, embasadas em provas sorológicas, têm revelado que a população de gatos, nos diferentes países, apresenta prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii entre 0 e 100% (DUBEY & BEATRICE, 1989; LAPPIN et al., 1989b; UGGLA, 1990). Por outro lado, os levantamentos sorológicos apresentam, por vezes, resultados díspares em razão de inúmeros fatores, entre os quais: a estrutura e condições da população de gato estudada; a natureza das provas sorológicas adotadas; as amostras do parasita utilizadas como antígeno e/ou como indutoras do processo doença. Diante de tal diversidade, numerosos estudos experimentais têm sido idealizados, objetivando apreciar, em condições controladas, os aspectos apontados, em especial, para a elucidação da composição antigênica e correspondente capacidade imunogênica do T. gondii. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento imunogênico e antigênico de diferentes amostras de T. gondii inoculodas artificialmente em gatos. MATERIAIS E MÉTODOS Foram inoculados quatro camundongos com 0,2 ml de uma suspensão de taquizoítas vivos, de T. gondii, em solução salina (0,9% NaCl) estéril, obtida através da lavagem peritoneal de camundongos previamente inoculados, com cada uma das amostras do T. gondii, em estudo, VPS (humano), CPL-1 (caprino), CN (felino) e LIV-IV e LIV-V (suíno). Quarenta e oito horas após a inoculoção, os camundongos foram sacrificados em ambiente saturado com éter e, em seguida, procedeu-se a lavagem da cavidade peritoneal com 3ml de salina estéril, colhendo-se desta forma, a suspensão de taquizoítas vivos. Para remoção de células do hospedeiro, foi utilizada a filtração em membranas de policarbonato, com poros de 3mm (Nucleopore Corporation) segundo HANDMAN & REMINGTON (1980). Após purificação, as amostras foram centrifugadas (3.000 G 15 minutos), padronizadas por contagem dos taquizoítas em câmara de Neubauer e ressuspendidas em salina estéril. Cada uma das amostras assim preparadas, serviram como base para o antígeno na sorologia, como inóculo dos gatos e como antígeno para adsorção dos soros imunes. Para a obtenção dos soros, foram selecionados 10 (dez) gatos jovens, sem raça definida.com idade variando entre 3 e 4 meses e peso médio de 800 gramas e negativos (título menor que 1:8) para anticorpos anti-T. gondii pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), bem como ausência de oocistos de T. gondii nas fezes pela técnica de centrifugo-flutuação em açúcar (SHEATHER, 1923). Após um período de 30 dias, de rigoroso monitoramento, obteve-se soro de cada animal que serviu de controle negativo para todo o experimento. Os gatos foram inoculados, em duplicata, com 8 x 106 taquizoítas vivos de cada amostra, por via intraperitoneal e, 45 dias após, receberam uma segunda dose de 3x107 taquizoítas vivos pela mesma via. Os gatos foram observados durante todo o período experimental, sendo submetidos diariamente a exames clínicos. A cada 3 dias foram efetuadas colheitas de fezes, durante os 30 dias subseqüentes à inoculoção. Semanalmente procedeu-se à colheita de sangue, durante os 6 meses de duração do experimento. Os soros obtidos das amostras colhidas no 49° dia serviram como soros imunes, utilizados neste trabalho. Alíquotas de 0,5ml de cada soro imune foram utilizadas para ressuspender 107 taquizoítas vivos de cada amostra, previamente sedimentados a 15.000 G por três minutos em centrífuga de Eppendorf e incubados por 45 minutos, a 37 °C; novamente centrifugadas a 15.000 G, durante três minutos, separando-se o sobrenadante (soro adsorvido). Tal procedimento foi realizado três vezes com todas as amostras. Posteriormente, testou-se a reatividade dos soros adsorvidos com as 5 amostras do parasita, pela RIFI. Os aspectos imunogênicos e os antigênicos foram analisados pela RIFI, como se segue. Os antígenos utilizados foram preparados a partir de cada amostra, segun- do técnica descrita por CAMARGO (1973). As amostras dos soros, diluídas em PBS pH 7,2 (1:16, 1:64, 1:128, 1:256, 1:1.024, 1:4.096, 1:8.192, 1:16.384, l :32.768) foram incubadas com as varias amostras do parasita em lâminas apropriadas para imunofluorescência. Utilizou-se o conjugado IgG de coelho, anti-IgG de gato, marcado com isoticianato de fluoresceína SIGMA/CHEMICAL. Foi utilizado um microscópio de imunufluorescência Nikon, dotado de epiluminação por lâmpada de halogênio, filtro B, para leitura das reações. Em todas as lâminas havia um soro controle positivo e um soro controle negativo, os quais orientavam a interpretação de cada reação, de acordo com a intensidade e localização da fluorescência visualizada nos taquizoítas, segundo CAMARGO (1973). RESULTADOS O acompanhamento clínico dos gatos, durante o experimento de imunização, revelou em todos os animais, quadro clínico compatível com a toxoplasmose aguda, com sinais clínicos que variaram de hipertermia (38,5 a 40,3 °C) à corrimento ocular com quadro pulmonar e fezes pastosas a líquidas. Apesar disso, nenhum animal eliminou oocistos de T.gondii, que pudessem ser detectados pela técnica utilizada (SHEATHER.1923). O título médio de anticorpos dos animais de cada grupo aferidos pela RIFI, segundo a amostra e o momento da sangria, estão expostos na Tabela l. Observou-se ainda os resultados obtidos pela primeira imunização, mostrando títulos oscilando entre 1:256 e 1:16.384; na 4ª semana, após a dose de reforço, a resposta imune foi mais intensa, revelando títulos de anticorpos (RIFI) com valores médios que oscilaram entre 1:4.096 e 1:16.384. A partir da 8ª semana pós inoculoção inicial, os valores dos títulos de anticorpos (RIFI) apresentaram uma tendência decrescente até uma aparente estabilidade da ordem de l :256 a l :4.096, condição essa que prevaleceu até o final do experimento, na 24ª semana. Os valores da Tabela 2 evidenciam uma similitude dos perfis imunológícos qualitativos correspondente à cada uma das amostras estudadas, que registra os valores médios da recíproca dos títulos de anticorpos (RIFI), expresso em log(10), segundo amostra do parasita e o momento de sangria dos animais. Os resultados individuais de cada soro nas reações homólogas e heterólogas estão na Tabela 3, onde os valores obtidos indicaram que, ainda quando os soros apresentassem níveis diferentes de anticorpos, o resultado da prova independeu da amostra antigênica utilizada, apontando para uma unicidade imunológica. A condição apontada em relação aos dados da Tabela 3 persistiu, mesmo quando os soros foram submetidos à adsorção de anticorpos frente a amostras homologas e heterólogas, conforme indicam os valores inseridos na Tabela 3, que contempla as recíprocas dos títulos de anticorpos (RIFI) dos soros de gatos, inoculados com diferentes amostras de T.gondii, adsorvidos com amostras antigênicas homólogas e heterólogas do parasita. Essa adsorção acarretou uma queda evidente nos títulos, tanto homólogo como heterólogo de anticorpos (RIFI) deste soro, com flutuação que oscilou dentro de uma faixa de l a 2 diluições. O exame da Tabela 4, exemplifica o ocorrido com cada uma das amostras que foram submetidas à adsorção homóloga e heteróloga, evidenciando um perfil de tendência decrescente nos valores dos títulos de anticorpos (RIFI) dos soros, persistindo, à medida que repetições de adsorções foram procedidas, queda esta que também se refletiu nas reações heterólogas DISCUSSÃO Os resultados obtidos no presente estudo põem em evidência relevantes aspectos relativos à história natural da toxoplasmose, em gatos. Relativamente à patogenicidade do agente, constatamos que, exceção feita à amostra CPL-I, as demais foram capaz de induzir um quadro clínico, em gatos, similar ao perfil sintomatológico mais comumente descrito para toxoplasmose nessa espécie, inclusive com um caso de óbito ao 9° dia pós-infeção, apesar de nenhum animal elimi- nar oocistos de Toxoplasma gondii. Mesmo considerando o reduzido número de animais inoculados por amostra utilizada (dois por amostra), a observação global, concernente ao perfil da doença clínica, está em consonância com os achados de DUBEY (1972; 1995), FRENKEL & SMITH (1992), HENRIKSEN et al. (1994), contudo, discorda desses mesmos autores no tocante à eliminação de oocistos. Por oportuno HAGIWARA et al. (1981) justificam tal diferença pela resposta do organismo ao Toxoplasma gondii em função da via de inoculoção e/ou da dose do inóculo, bem como do estágio do parasita inoculodo. No que concerne à resposta imunitária, os resultados nas Tabelas l e 2 mostram que os níveis de anticorpos induzidos, em gatos, expressos pelos valores médios da recíproca dos títulos, obtidos pela RIFI, apontam na reação com soros homólogos, uma semelhança no perfil imunológico qualitativo, ainda que oscilações individuais na intensidade da resposta imune tenham sido observadas. Tais flutuações, particularmente importantes em experimentos de natureza quantitativa, poderiam estar associadas à capacidade de resposta individual dos animais utilizados ou a problemas inerentes ao próprio método de imunofluorescência indireta, que admite variações da ordem de uma diluição CAMARGO (1973), MITSUKA et al. (1991), OMATA et al. (1994). De fato, como bem enfatiza SHARMA (1990), os gens dos antígenos de histocompatibilidade H-2 constituem a base da resistência do hospedeiro à toxoplasmose. Como os gatos utilizados no presente experimento não eram geneticamente homogêneos parece perfeitamente coerente que apresentassem diferenças genéticas capazes de contribuir para a variação da intensidade da resposta imune. Por outro lado, quando se procura consolidar a informação obtida em tais perfis, através de reações cruzadas, onde cada um dos antígenos, de per si, era con- frontado com o soro de todas as amostras estudadas, obteve-se os resultados da Tabela 3, que mostram terem sido as reações heterólogas absolutamente equivalentes, em termos qualitativos, às homólogas, sugerindo que os soros obtidos, independentemente da amostra utilizada na indução de anticorpos, reconheceu, igualmente, todos as amostras do parasita examinadas. Isso posto, parece lícito afirmar-se que, qualquer que seja o antígeno utilizado, o resultado sorológico obtido pela RIFI será, provavelmente, o mesmo. Como essa técnica é realizada com anticorpos policlonais, compreendendo anticorpos contra o conjunto de todos os determinantes antigênicos do parasita, tanto citoplasmático como de superfície, o resultado final é igual, não permitindo qualquer distinção entre as amostras por ela analisadas. DUBEY et al. (1989) e LAPPIN et al. (1989a,c), trabalhando com gatos infectados com oocistos de Toxoplasma gondii, e utilizando como provas sorológicas a hemaglutinação indireta, látex aglutinação, Sabin-Feldman e aglutinação modificada, constataram também a identidade do perfil imunológico de amostras desse parasita. Os resultados obtidos tornam-se ainda mais consistentes quando cada soro, de per si, foi submetido à adsorção pelas diferentes amostras de antígeno utilizadas. De fato, quando taquizoítas vivos, das diferentes amostras de Toxoplasma gondii, foram adicionados, em excesso, às alíquotas dos anti-soros, incubados e sedimentados, os anticorpos que reconheceram os componentes da superfície dos parasitas devem ter sido consumidos, o que explica a redução dos títulos, observada na Tabela 4. Os valores dessa tabela mostram que, a despeito da redução dos títulos de anticorpos, o perfil imunológico das amostras não apresentou modificações. Ainda após a repetição da operação de adsorção, quando se verificou nova queda acentuada nos títulos de anticorpos, a reação cruzada entre as amostras permaneceu inalterada, conforme se configura na apreciação das Tabela 4. Corroboram com estes achados as observações de BEKNER SILVA et al. (1994) que, trabalhando com suínos, demonstraram, igualmente, a equivalência da resposta imune, homóloga e heteróloga, de amostras do Toxoplasma gondii, bem como a redução dos títulos de anti-corpos, quando da adsorção dos soros específicos com taquizoítas vivos. Esses autores sugerem que os antígenos de superfície poderiam ser responsáveis pela maior aparte das reações sorológicas de Toxoplasma gondii, as quais seriam semelhantes em todas amostras do parasita; e que a reação de imunofluorescência indireta não se mostrou adequada para distinguir sorologicamente amostras do parasita. 1 Financiado: CPG / UEL e CNPq. 2 Médico Veterinário, Doutor, Professores do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva - Centro de Ciências Agrárias - Universidade Estadual de Londrina (UEL), Campus Universitário, Caixa Postal 6001, 86051-990, Londrina, PR. E-mail: [e-mail]. Autor para correspondência. 3 Médico Veterinário, Mestranda do Departamento de Patologia Geral (DPG), Centro de Ciências Biológicas (CCB), UEL. 4 Biólogo, Doutor, Professor do DPG, CCB, UEL. 5 Acadêmico do curso de Medicina Veterinária da UEL, Bolsista I C / CNPq. 6 Médico Veterinário, Doutor, Professor do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, FMVZ.Universidade de São Paulo - USP. Recebido para publicação em 29.09.97. Aprovado em 04.03.98 APTL, W., THERMANN, E., NIEDMAN, G., et al. Toxoplasmosis. Santiago, Arancibia Horns, 1973, 160 p. Toxoplasmosis 1973 APTL W. THERMANN E. NIEDMAN G. BECKNER SILVA, A.C., MITSUKA, R., NAVARRO, I.T., et al. Immunogenic and antigenic aspects from different Toxoplasma gondii strains inoculated in swine and evaluated by indirect immunofluorescence. Rev Bras Parasitol Vet, v. 3, n. l, p.17-22, 1994. 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