Efeitos de dexmedetomidina em conjunto com o pré-condicionamento isquêmico remoto em lesão de isquemia-reperfusão renal em ratos

Emine Bagcik Sevda Ozkardesler Nilay Boztas Bekir Ugur Ergur Mert Akan Mehmet Guneli Sule Ozbilgin Sobre os autores

Resumos

Background and objectives:

The aim of this study was to evaluate the effects of remote ischemic preconditioning by brief ischemia of unilateral hind limb when combined with dexmedetomidine on renal ischemia-reperfusion injury by histopathology and active caspase-3 immunoreactivity in rats.

Methods:

28 Wistar albino male rats were divided into 4 groups. Group I (Sham, n = 7): Laparotomy and renal pedicle dissection were performed at 65th minute of anesthesia and the rats were observed under anesthesia for 130min. Group II (ischemia-reperfusion, n = 7): At 65th minute of anesthesia bilateral renal pedicles were clamped. After 60 min ischemia 24 h of reperfusion was performed. Group III (ischemia-reperfusion + dexmedetomidine, n = 7): At the fifth minute of reperfusion (100 μg/kg intra-peritoneal) dexmedetomidine was administered with ischemia-reperfusion group. Reperfusion lasted 24 h. Group IV (ischemia-reperfusion + remote ischemic preconditioning + dexmedetomidine, n = 7): After laparotomy, three cycles of ischemic preconditioning (10 min ischemia and 10 min reperfusion) were applied to the left hind limb and after 5 min with group III.

Results:

Histopathological injury scores and active caspase-3 immunoreactivity were significantly lower in the Sham group compared to the other groups. Histopathological injury scores in groups III and IV were significantly lower than group II (p = 0.03 and p = 0.05). Active caspase-3 immunoreactivity was significantly lower in the group IV than group II (p = 0.01) and there was no significant difference between group II and group III (p = 0.06).

Conclusions:

Pharmacologic conditioning with dexmedetomidine and remote ischemic preconditioning when combined with dexmedetomidine significantly decreases renal ischemia- reperfusion injury histomorphologically. Combined use of two methods prevents apoptosis via active caspase-3.

Kidney; Ischemia-reperfusion injury; Dexmedetomidine; Caspase-3; Ischemic preconditioning; Apoptosis


Justificativa e objetivos:

Avaliar os efeitos do pré-condicionamento isquêmico remoto, mediante breve isquemia de membro posterior unilateral, em combinação com dexmedetomidina em lesão de isquemia-reperfusão renal por meio de histopatologia e imunorreatividade da caspase-3 ativa em ratos.

Métodos:

Foram divididos em quatro grupos 28 ratos machos albinos Wistar. Grupo I (Sham cirurgia controle], n = 7): laparotomia e dissecção do pedículo renal foram feitas em 65 minutos de anestesia e os ratos foram observados sob anestesia por 130 minutos. Grupo II (isquemia-reperfusão, n = 7): no 65° minuto de anestesia, os pedículos renais bilaterais foram pinçados; após 60 minutos de isquemia, foi feita reperfusão de 24 horas. Grupo III (isquemia-reperfusão + dexmedetomidina, n = 7): no quinto minuto de reperfusão, dexmedetomidina (100 mg/kg intraperitoneal) foi administrada ao grupo com isquemia-reperfusão. A reperfusão durou 24 horas. Grupo IV (isquemia-reperfusão + pré-condicionamento isquêmico remoto + dexmedetomidina, n = 7): após a laparotomia, três ciclos de pré-condicionamento isquêmico (10minutos de isquemia e 10minutos de reperfusão) foram aplicados no membro posterior esquerdo e depois de cincominutos ao grupo III.

Resultados:

Os escores de lesão histopatológica e imunorreatividade da caspase-3 ativa foram significativamente menores no grupo Sham em comparação com os outros. Os escores de lesão histopatológica dos grupos III e IV foram significativamente menores do que os do II (p = 0,03 e p = 0,05). A imunorreatividade da caspase-3 foi significativamente menor no grupo IV do que no II (p = 0,01) e não houve diferença significante entre os grupos II e III (p = 0,06).

Conclusões:

O condicionamento farmacológico com dexmedetomidina e o pré-condicionamento isquêmico remoto em combinação com dexmedetomidina diminuem de modo significante a lesão de isquemia-reperfusão renal histomorfologicamente. O uso combinado dos dois métodos previne a apoptose via caspase-3 ativa.

Rim; Lesão de isquemia-reperfusão; Dexmedetomidine; Caspase-3; Pré-condicionamento isquêmico; Apoptose


Introducción y objetivos:

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos del precondicionamiento isquémico remoto mediante breve isquemia del miembro posterior unilateral en combinación con la dexmedetomidina en la lesión de isquemia-reperfusión renal por medio de histopatología e inmunoreactividad de la caspasa-3 activa en ratones.

Métodos:

28 ratones machos albinos Wistar fueron divididos en 4 grupos. Grupo I (Sham cirugía control], n =7): se realizó laparotomia y disección del pediculo renal en 65 min de anestesia y los ratones fueron observados bajo anestesia durante 130min. Grupo II (isquemia-reperfusión, n = 7): en el sexagésimo quinto minuto de anestesia, los pídiculos renales bilaterales fueron pinzados; después de 60min de isquemia, se realizaron 24h de reperfusión. Grupo III (isquemia-reperfusión + dexmedetomidina, n = 7): al quinto minuto de reperfusión, la dexmedetomidina (100 μg/kg intraperitoneal) fue administrada en el grupo con isquemia-reperfusión; la reperfusión duró 24 h. Grupo IV (isquemia-reperfusión + precondicionamiento isquémico remoto + dexmedetomidina, n=7): después de la laparotomía, se aplicaron 3 ciclos de precondicionamiento isquémico (10 min de isquemia y 10 min de reperfusión) en el miembro posterior izquierdo y después de 5 min en el grupo in.

Resultados:

Las puntuaciones de lesión histopatológica e inmunoreactividad de la caspasa-3 activa fueron significativamente menores en el grupo Sham en comparación con los otros grupos. Las puntuaciones de lesión histopatológica de los grupos III y IV fueron significativamente menores que las del grupo II (p = 0,03 y p = 0,05). La inmunorreactividad de la caspasa-3 fue significativamente menor en el grupo IV que en el grupo II (p = 0,01) y no hubo diferencia significativa entre los grupos II y III (p = 0,06).

Conclusiones:

El condicionamiento farmacológico con dexmedetomidina y precondicionamiento isquémico remoto en combinación con dexmedetomidina disminuyen de modo significativo la lesión de isquemia-reperfusión renal histomorfológicamente. El uso combinado de los 2 métodos previene la apoptosis via caspasa-3 activa.

Riñó; Lesión de isquemia-reperfusión; Dexmedetomidina; Caspasa-3; Precondicionamiento isquémico; Apoptosis


Introducão

A lesão renal aguda isquêmica é uma síndrome clínica com altas taxas de mortalidade e morbidade. Por causa da grande demanda de energia e da complexa rede da micro-vasculatura renal, o rim é altamente sensível à lesão de isquemia-reperfusão (IR).1. Ojo AO, Wolfe RA, Held PJ, et al. Delayed graft function: risk factors and implications for renal allograft survival. Transplantation. 1997;63:968-74.-Os mecanismos da lesão de IR renal são multifatoriais, incluindo hipóxia, danos aos radicais livres e respostas inflamatórias sistémicas.5. Collard CD, Gelman S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 2001;94:1133-8. A reperfusão isquêmica do tecido renal induz condições celulares complexas e morte das células renais por causa da apoptose.6. Tsutsui H, Sugiura T, Hayashi K, et al. Moxonidine prevents ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats. Eur J Pharmacol. 2009;603:73-8.

Apoptose é uma forma de morte celular programada geneticamente. Duas vías principais desempenham um papel na apoptose epitelial. A primeira, conhecida como a via extrínseca ou de receptor de morte, é estimulada por moléculas da família TNF-α ligada ao CD95 (ligando Fas = CD95) através de sinais extracelulares. Essa via se conecta com a segunda, a intrínseca ou mitocondrial, por meio da ativação da caspase-3, que inclui o citocromo c e a família de proteínas Bcl-2, que, em conjunto, aumentam a apoptose.7. Yazici P, Alizadehshargh S, Akdogan G. Apoptosis: regulatory molecules, relationships with diseases and apoptosis detection methods. Turkiye Klinikleri J Med Sci. 2009;29:1677-86.

A apoptose de células tubulares renais é o resultado de uma lesão renal e o primeiro e importante contribuinte da fisiopatologia da IR. Tanto a inflamacão quanto a apoptose coexistem em lesão de IR renal. Durante a hipóxia, a atividade da caspase aumenta como resultado do acúmulo intracelular de Ca2+. A caspase torna-se ativa nos tecidos isquêmicos e é um indicador de morte celular.8. Faubel S, Edelstein CL. Caspases as drug targets in ischemic organ injury. Immune Endocr Metabol Disord. 2005;5:269-87. Essas alterações, que podem ser observadas em células tubulares, podem causar a perda das bordas em escova das células tubulares proximais e vazar da membrana basal das células para o lume tubular, com eventual obstrucão do túbulo.9. Noiri E, Gailit J, Sheth D, et al. Cyclic RGD peptides ameliorate ischemic acute renal failure in rats. Kidney Int. 1994;46:1050-8.,1010 . Friedewald JJ, Rabb H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 2004;66:486-91.

Entre os métodos usados para reduzir os efeitos da lesão de IR, o pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR) e o condicionamento farmacológico são os mais comuns.1111 . Tapuria N, Kumar Y, Habib MM, et al. Remote ischemic preconditioning: a novel protective method from ischemia reperfusion injury - a review. J Surg Res. 2008;150:304-30. Na revisão da literatura de língua inglesa, não encontramos estudo de modelo de IR experimental que investigasse os efeitos do uso de condicionamento farmacológico com dex-medetomidina administrada em combinação com PCIR.

O objetivo deste estudo experimental foi investigar histopatologicamente os efeitos renais do PCIR unilateral administrado em combinação com dexmedetomidina em extremidade inferior e avaliar a imunorreatividade da caspase-3 ativa em modelo de IR renal em ratos.

Materiais e métodos

Foram usados 28 ratos adultos machos, albinos Wistar, com 250-300g. Até o início da pesquisa, os ratos foram mantidos em temperatura ambiente (21-22 ° C) e umidade relativa (40-60%) em um ciclo de claro/escuro (12/12-h) e alimentados com dieta padrão de racão e água ad libitum. Após a aprovacão do Comitê de Ética em Experimentacão Animal da instituicão, o estudo foi feito no Laboratório Multidisciplinar de Experimentacão Animal. A anestesia foi fornecida com cetamina (50 mg/kg) ecloridrato dexilazina (10 mg/kg) e administrada por via intraperitoneal (IP). Após a anestesia, os animais foram divididos em quatro grupos.

Grupo i (Sham, n = 7): Após a laparotomia, os pedículos renais, direito e esquerdo, foram expostos no minuto 65 da anestesia e os ratos foram mantidos sob anestesia por 130 minutos sem outra intervenção.

Grupo II (IR, n = 7): Após 60 minutos de isquemia, o clampe foi removido e a reperfusão dos rins foi permitida por 24 horas.

Grupo III (IR + dexmedetomidina, n = 7): Após 60minutos de isquemia, o clampe foi removido, 100 μg/kg de dexmedetomidina (Precedex 100 μg/2 mL, Abbott Laboratories, IL, EUA) foram administrados por via IP e a reperfusão dos rins foi permitida por 24 horas.

Grupo IV (IR + PCIR + dexmedetomidina, n = 7): Em seguida à laparotomia, após cinco minutos de PCIR e 60 minutos subsequentes de isquemia renal, o clampe foi removido, 100 μg/kg de dexmedetomidina (Precedex 100 μg/2mL, Abbott Laboratories) foram administrados e, finalmente, foi feita reperfusão de 24horas (fig. 1).

Figura 1
Representação esquemática do protocolo experimental. I, isquemia; R, reperfusão; D, dexmedetomidina.

Expor os pedículos renais no Grupo I e iniciar a isquemia no minuto 65da anestesia nos grupos II e III foi determinado para sincronizar todos os grupos para o tempo de pré-condicionamento do grupo IV e padronizar o início dos procedimentos. As amostras de tecido foram obtidas após 24 horas de reperfusão.

Para proteger os ratos da hipotermia, a mesa de operação foi aquecida com um aquecedor de lâmpada durante o estudo e a temperatura corporal foi medida com uma sonda retal e mantida a 3.737,5° C. Solucão salina por via subcutânea a cada hora, dosagem de 3 mL/kg, foi administrada para prevenir a desidratação. Durante o tempo de espera, o abdome foi fechado com tampão de gaze estéril úmida e pinca cirúrgica. Em todos os grupos, o rim esquerdo foi removido sob anestesia para análises histomorfológicas e os ratos foram sacrificados por sangria de puncão cardíaca ao término do estudo. Os rins foram fixados em formol tamponado a 10% e embebidos em parafina, cortados em lâminas de 4-5 μm e corados com hematoxilina e eosina para estudo histológico com o uso de microscópio de luz.

Modelo de IR renal

Os pedículos renais bilaterais foram expostos após a laparotomia. A isquemia renal total dos pedículos renais bilaterais foi mantida com clampeamento microvascular atraumático. A oclusão adequada foi confirmada pela falta de pulsacão nos pedículos renais e pela palidez dos rins. Após o período isquêmico, os clampes microvasculares foram removidos e a reperfusão ocorreu.

Modelo de PCIR

Para o efeito do torniquete do PCIR, um método que mostrou ser eficaz por cintilografia de perfusão e um medidor de laser foram usados.1212 . Kanoria S, Jalan R, Davies NA, et al. Remote ischaemic preconditioning of the hind limb reduces experimental liver warm ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg. 2006;93:762-8.,1313 . Duru S, Koca U, Oztekin S, et al. Antithrombin III pretreatment reduces neutrophil recruitment into lung and skeletal muscle tissues in the rat model of bilateral lower limb ischaemia and reperfusion: a pilot study. Acta Anaesthesiol Scand. 2005;49:1142-8. Para essa finalidade, o membro posterior esquerdo do rato foi preso com uma tira elástica (1 cm de largura e 30 cm de comprimento) na virilha e se aplicou pressão ao redor. Três ciclos de 10 minutos de isquemia foram feitos, seguidos por 10 minutos de reperfusão (65 minutos no total). A interrupção do fluxo sanguíneo foi confirmada com o uso de um medidor da corrente do laser (laser Flo BPM2, Vasamedic, EUA).

Avaliação histomorfológica de tecido renal

As seccões de tecido renal após IR foram avaliadas por microscopia de luz por dois histologistas, «cegos» para as designacções dos grupos de animais, que investigaram as alteracções estruturais dos túbulos proximais (atrofia tubular, perda de borda tubular em escova, vacuolização, dilatação tubular, formacão de cálculo), a infiltração de células mononucleares (CMN), as alterações intersticiais estruturais, a morfologia do corpúsculo renal e as células em necrose e apoptose.

A classificacão das imagens transversais foi feita por meio de escores semiquantitativos quanto a lesões tubuloin-tersticiais da seguinte forma: 0 = nenhuma lesão, 1 =0-25%, 2 = 26-45%, 3 = 46-75% e 4 = 76-100%.1414 . Feng L, Xiong Y, Cheng F, et al. Effect of ligustrazine on ischemia-reperfusion injury in murine kidney. Transplant Proc. 2004;36:1949-51.

Métodos de imuno-histoquímica

Os tecidos renais foram fixados em formol tamponado a 10% e, depois dos procedimentos histológicos de rotina, foram embebidos em parafina e seccionados em cortes de 3 μm de espessura com um micrótomo e coletados em lâminas revestidas com poli-L-lisina.

As amostras foram armazenadas em forno a 60°C durante 12 horas. Em seguida, um anticorpo monoclonal anticaspase-3 específico para rato (RB-10287-R7 LabVision) foi usado para avaliar a imunorreatividade anticaspase-3.

A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com uma solucão de peróxido de hidrogénio a 3% em álcool. As seccões de lisina foram tratadas com o anticorpo anticaspase-3 a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incubadas com um anticorpo secundário biotinilado durante 30 minutos. Depois da aplicação do kit Vector Elite ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EUA), o complexo biotina-avidina-peroxidase para o anticorpo foi visualizado com 0,02% de solucão de 3,3'-diaminobenzidina. Após a contracoloracão com hematoxilina de Mayer, a imagem foi analisada.

A taxa de coloração positiva foi avaliada com um indicador de escore semiquantitativo (1-4) para densidade e distribuição.

Critérios de exclusão

Os ratos que precisaram de reanimação foram excluídos do estudo.

Análise estatística

O programa SPSS (versão 15,0; SPSS, Chicago, IL, EUA) foi usado. A análise de variância de Kruskal-Wallis foi feita. O teste U de Mann-Whitney foi usado para as comparacões pareadas dos grupos. Todos os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Os valores de p<0,05 foram considerados como indicadores de significância estatística.

Resultados

Um rato do grupo IV morreu durante o período de reperfusão e foi excluído do estudo. Os escores histomorfológicos e imuno-histoquímicos das lesões dos grupos de estudo são apresentados nas tabelas 1 e 2.

Tabela 1
Resultados histomorfológicos das lesões dos grupos
Tabela 2
Resultados imuno-histoquímicos das lesões dos grupos

Escores histomorfológicos das lesões renais

Infiltração de CMN: Os escores histomorfológicos das lesões do grupo Sham foram significativamente menores do que os do grupo IV (p = 0,01). Os escores das lesões do grupo IR foram significativamente maiores do que os dos grupos IR + Dexe IR + PCIR + Dex (p = 0,04 e p = 0,04, respectivamente; fig. 2).

Figura 2
Escores de infiltração de células mononucleares detectada por exame histomorfológico renal. *Comparação do grupo IR com o grupo Sham (p = 0,01). Comparação dos grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex com o grupo IV (p < 0,05).

Alterações estruturais dos túbulos proximais: Os escores histomorfológicos das lesões do grupo Sham foram significativamente menores do que os dos grupos IR, IR + Dex, e IR + PCIR + Dex (p<0,01, p = 0,02 e p = 0,02, respectivamente). O grupo IR apresentou escores significativamente mais elevados do que os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 0,05 e p = 0,05, respectivamente), enquanto que não houve diferença significativa entre os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 1,00; fig. 3).

Figura 3
Escores de alteração de lesão tubular detectada pelo exame histomorfológico renal. *Comparação dos grupos IR, IR + Dex e IR + PCIR + Dex com o grupo Sham (p < 0,01). Comparação do grupo IR com os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 0,05).

Alterações glomerulares: Os escores histomorfológicos das lesões do Sham foram significativamente menores do que os do grupo IV (p = 0,04). O grupo IR apresentou escores significativamente mais elevado do que os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 0,04 e p = 0,04, respectivamente), enquanto não houve diferença significativa entre os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 1,00; fig. 4).

Figura 4
Escores de alteracão de lesão glomerular detectada por histomorfología renal. *Comparação do grupo IR com o grupo Sham (p < 0,01). Comparação do grupo IR com os grupos IR + Dex e IR+ PCIR + Dex (p < 0,05).

Escore histopatológico total das lesões: O do grupo Sham foi significativamente menor do que o do grupo IV (p = 0,003). A comparação do grupo IR com os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex mostrou escores significativamente mais elevados do que os do grupo IR (p = 0,03 e p = 0,05, respectivamente), enquanto não houve diferença significante entre os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 0,79; fig. 5).

Figura 5
Escore histopatológico total das lesões detectadas por histomorfología renal. *Comparação do grupo IR com o grupo Sham (p < 0,01). Comparação do grupo IR com os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p < 0,05).

Escore imuno-histoquímico das lesões: Os escores da coloracão imuno-histoquímica do grupo IR foram significativamente maiores do que os do grupo Sham (p = 0,001). Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos IR e IR + Dex (p = 0,06).

Na comparação dos escores das lesões entre os grupos IR + PCIR + Dex e IR, os do grupo IR + PCIR + Dex foram significativamente menores (p = 0,01). Os escores das lesões dos grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex não diferiram (p = 0,47; fig. 6).

Figura 6
Escore da imuno-histoquímica renal. *Comparação do grupo IR com o grupo Sham (p < 0,01). Comparação do grupo IR com os grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex (p = 0,01).

Nenhuma infiltração celular ou perda de borda em escova foi observada nas secções do grupo Sham (fig. 7 A e B). Contudo, no grupo iV, observamos infiltracção peritubular de CMN, mais proeminente na área cortical, e perda de borda em escova das células do túbulo proximal, atrofia tubular, dilatação tubular e vacuolizacão. Em alguns dos túbulos, acúmulo de material proteico, em conjunto com a formacão de castas e detritos celulares no lume dos túbulos, foi observado (fig. 8 A e B).

Figura 7
Seções (A e B) do grupo Sham. G, glomerular; P, túbulo proximal; D, túbulo distal, borda em escova.
Figura 8
Seções (A e B) do grupo IR. L, glomerular; P, tubulo proximal; D, tubulo distal; (fx1), acumulo de material proteico nos tubulos; (⋆), vertido para dentro do lume de células epiteliais tubulares.

No grupo IR + Dex, houve perda de borda em escova das células tubulares, atrofia tubular, dilatação tubular, vacuolizacão e acúmulo de material proteico e detritos celulares no lume dos tubulos, porém em menor quantidade do que no grupo IR (fig. 9 A e B).

Figura 9
Seções (A e B) do grupo IR + Dex. G, glomerular; P, túbulo proximal; D, túbulo distal; (fx2), acúmulo de material proteico a ser reduzido em comparação com os outros grupos.

Comparado com o grupo IR, o grupo IR + PCIR + Dex apresentou atrofia tubular, dilatação tubular, vacuolização, acúmulo de material proteico e detritos celulares no lume dos túbulos e perda de borda em escova das células tubulares, embora em menor quantidade. No entanto, em comparação com o grupo IR + Dex, as alterações tubulares foram menos acentuadas (fig. 10 A e B21 . Fujii T, Takaoka M, Muraoka T, et al. Preventive effect of lcarnosine on ischemia/reperfusion-induced acute renal failure in rats. Eur J Pharmacol. 2003;474:261-7.).

Figura 10
Secções (A e B) do grupo IR + PCIR + Dex. G, glomerular; P, túbulo proximal; D, túbulo distal; (fx3), acúmulo de material proteico de ser reduzido em comparação com os outros grupos.

A intensidade da coloração imuno-histoquímica foi maior nas células positivas para caspase-3 ativa no grupo IR em comparação com o grupo Sham, enquanto foi menor nas células dos grupos IR + Dex e IR + PCIR + Dex comparados com o grupo IR. A intensidade da coloração das células positivas para caspase-3 ativa do grupo IR + PCIR + Dex foi menor em comparação com o grupo IR + Dex (fig. 11).

Figura 11
Imagens seccionais coradas da caspase-3 na imuno-histoquímica dos grupos experimentais. (A) Sham, (B) IR, (C) IR + Dex e (D) IR+ PCIR + Dex; fx4, imunocoloração da caspase-3 ativa indica células epiteliais positivas no túbulo proximal. (C e D) Secções de imunocoloração da caspase-3 ativa positiva observada nas células epiteliais do túbulo proximal, diminuída no grupo B.

Discussão

A insuficiência renal aguda que ocorre como resultado de isquemia pode ser causada por hipotensão, hipovolemia e hipoperfusão secundária à desidratacão, bem como lesão de IR em cirurgias de grande porte, como as cardiotorácicas, vasculares e transplantes.1515 . Thadhani R, Pascual M, Bonventre JV. Acute renal failure. N Engl J Med. 1996;334:1448-60.1818 . Gu J, Pamela S, Hailin Z, et al. Dexmedetomidine provides renoprotection against ischemia-reperfusion injury in mice. Crit Care. 2011;15:R153. A lesão de IR é uma das causas mais comuns de insuficiência renal aguda no perioperatório.1818 . Gu J, Pamela S, Hailin Z, et al. Dexmedetomidine provides renoprotection against ischemia-reperfusion injury in mice. Crit Care. 2011;15:R153.

Métodos como o PCIR e o condicionamento farmacológico com dexmedetomidina, que são usados para prevenir ou tratar lesões de IR renal, têm mostrado efeitos positivos em lesão de IR em muitos estudos anteriores.1111 . Tapuria N, Kumar Y, Habib MM, et al. Remote ischemic preconditioning: a novel protective method from ischemia reperfusion injury - a review. J Surg Res. 2008;150:304-30.

Em pesquisa na literatura, não encontramos estudo que avaliasse os efeitos da combinação desses dois métodos em lesão de IR. Este estudo experimental, com um modelo de rato de IR renal, comparou os efeitos do uso de dexmedetomidina pura ou PCIR em combinação com dexmedetomidina contra a apoptose renal e os avaliou por meio da imunor-reatividade da caspase-3 e de escores histopatológicos das lesões.

De acordo com nossos resultados, o uso de dexmedetomidina pura ou em combinação com PCIR reduziu significativamente a infiltração de CMN, as alterações glomerulotubulares e o escore total de lesões de IR. Em ambos os grupos, todos os escores, exceto para os de alterações tubulares (p = 0,05), foram semelhantes aos do grupo Sham. Houve redução significativa da imunorre-atividade da caspase-3 no grupo dexmedetomidina em combinação com PCIR, o que sugere que a apoptose, a principal via de lesão IR, pode ser reduzida ou prevenida com o uso dessa combinação.

Vários períodos de isquemia e reperfusão foram usados em modelos de lesão de IR renal em muitos estudos.1919 . Kocoğlu H, Ozturk H, Ozturk H, et al. Effect of dexmedetomidine on ischemia-reperfusion injury in rat kidney: a histopathologic study. Ren Fail. 2009;31:70-4.2222 . Hussein Ael-A, Shkeir AA, Sarhan ME, et al. Effects of combined erythropoietin and epidermal growth factor on renal ischaemia/reperfusion injury: a randomized experimental controlled study. BJU Int. 2011;107:323-8. O período isquêmico crítico depende do órgão e isquemia com duração superior a cinco minutos para o cérebro e 15-20 minutos para o fígado e o rim pode causar morte neuronal e infarto.2323 . Jaeschke H, Farhood A. Kupffer cell activation after no-flow ischemia versus hemorrhagic shock. Free Radic Biol Med. 2002;33:210-9. Williams et al.2020 . Williams P, Lopez H, Britt D, et al. Characterization of renal ischemia-reperfusion injury in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 1997;37:1-7. investigaram os efeitos da lesão de IR em amostras de sangue e tecidos obtidos pós-reperfusão após 45 minutos de isquemia renal e relataram que a lesão de IR renal ocorreu mais cedo -na quarta hora - e atingiu o pico na 24a hora.

Os efeitos protetores de órgãos da dexmedetomidina contra a lesão de IR foram demonstrados em vários tecidos, como o cérebro, o coração e os rins.2424 . Sanders RD, Maze M. Alpha 2-adrenoceptor agonists. Curr Opin Investig Drugs. 2007;8:25-33.2727 . Kuhmonen J, Pokorny J, Miettinen R, et al. Neuroprotective effects of dexmedetomidine in the gerbil hippocampus after transient global ischemia. Anesthesiology. 1997;87:371-7. Os efeitos de dexmedetomidina em lesão de IR renal em ratos foram investigados por Kocoğlu et al.1919 . Kocoğlu H, Ozturk H, Ozturk H, et al. Effect of dexmedetomidine on ischemia-reperfusion injury in rat kidney: a histopathologic study. Ren Fail. 2009;31:70-4. Esses pesquisadores relataram uma diminuição significativa nos escores histopatológicos de lesão, detectados no minuto 45 após a administração IP de 100 μg/kg de dexmedetomidina no início da reperfusão. Em nosso estudo, com a mesma dose de dexmedetomidina administrada no início da reperfusão, um efeito renoprotetor foi obtido, como evidenciado por reduções significativas dos escores histológicos das lesões. Esse efeito renoprotetor foi encontrado não só durante o período inicial após a lesão de reperfusão, mas permaneceu até a 24a hora, que foi considerada o pico da lesão de IR.2020 . Williams P, Lopez H, Britt D, et al. Characterization of renal ischemia-reperfusion injury in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 1997;37:1-7.

Embora o mecanismo subjacente ao efeito protetor de dexmedetomidina em IR renal não esteja claro, considera-se que dexmedetomidina aumenta o fluxo sanguíneo renal e a filtração glomerular e reduz a liberação de noradrenalina.2828 . Taoda M, Adachi YU, Uchihashi Y, et al. Effect of dexmedetomidine on the release of 3H]-noradrenaline from rat kidney cortex slices: characterization of alpha2-adrenoceptor. Neurochem Int. 2001;38:317-22.

Villela et al., 2929 . Villela NR, Nascimento PVN, Carvalho LR. Effects of dexmedetomidine on renal system and on vasopressin plasma levels. Experimental study in dogs. Rev Bras Anestesiol. 2005;55:429-40. relataram que a administração de dexmedetomidina em dose baixa em cães anestesiados reduziu a osmolalidade urinária e o nível plasmático de vasopres-sina e causou a diurese de água livre. Em pacientes que não apresentavam doenca renal, mas foram submetidos à cirurgia torácica, ao administrar uma infusão de dexmedetomidina, Frumento et al.3030 . Frumento RJ, Logginidou HG, Wahlander S, et al. Dexmedetomidine infusion is associated with enhanced renal function after thoracic surgery. J Clin Anesth. 2006;18:422-6. relataram melhoria da função renal, inclusive do fluxo urinário e da filtração glomerular no período pós-operatório.

Um dos mecanismos mais prováveis da ação de dexme-detomidina é proteger o rim ao inibir a resposta ao estresse cirúrgico e prevenir a vasoconstrição mediada pelo sistema adrenérgico.3131 . Kulka PJ, Tryba M, Zenz M. Preoperative alpha 2-adrenergic receptor agonists prevent the deterioration of renal function after cardiac surgery: results of a randomized, controlled trial. Crit Care Med. 1996;24:947-52.3434 . Flacke JW, Bloor BC, Flacke WE, et al. Reduced narcotic requirement by clonidine with improved hemodynamic and adrenergic stability in patients undergoing coronary bypass surgery. Anesthesiology. 1987;67:11-9. Esse mecanismo de ação também pode aumentar a vasodilatação arterial renal por meio de efeitos vasculares diretos.1919 . Kocoğlu H, Ozturk H, Ozturk H, et al. Effect of dexmedetomidine on ischemia-reperfusion injury in rat kidney: a histopathologic study. Ren Fail. 2009;31:70-4. Há relato de que PKC desempenha um papel importante no pré-condicionamento isquêmico e abre os canais de K+ dependentes de ATP mitocondrial e sarcolemático ao estimular as vías de transdução intracelular e induzir a síntese de proteínas celulares protetoras. Em um estudo das vías opcionais de transdução de sinal, os agonistas do receptor alfa-2B mostraram estimular a atividade de PKC e a produção de trifosfato de inositol em células de túbulos coletores renais distais, o que sugere que os agonistas alfa-2 imitam a proteção celular mímico por PCI.3535 . Gesek FA. Alpha2-adrenergic receptors activate phospholipase C in renal epithelial cells. Mol Pharmacol. 1996;50:407-14.,3636 . O'Rourke B. Evidence for mitochondrial K+ channels and their role in cardioprotection. Circ Res. 2004;94:420-32. Gu et al., 1818 . Gu J, Pamela S, Hailin Z, et al. Dexmedetomidine provides renoprotection against ischemia-reperfusion injury in mice. Crit Care. 2011;15:R153. investigaram o mecanismo de acão de dexmedetomidina in vitro com cultura de células humanas estabilizadas do túbulo proximal renal, privadas de oxigênio e glicose. Os pesquisadores relataram tanto um aumento significativo da expressão de fosfo-Akt em cultura de células tubulares após tratamento com dexmedetomidina, dependente da dose, quanto um efeito do adrenoreceptor alfa-2. A via fosfo-Akt garante a viabilidade celular ao inibir as vías de apoptose intrínsecas controladas por caspase por meio da fosforilação da Bcl-2 pró-apoptótica, o que desencadeia a morte celular e o aumento das expressões de Bcl-2 e Bcl-XL antiapoptóticas.

O efeito neuroprotetor de dexmedetomidina foi relatado como o resultado de um aumento das expressões de Bcl-2 e Mdm-2 antiapoptóticas; esse aumento tem sido associado a uma reducção dos níveis de caspase-3 e Bax3737 . Engelhard K, Werner C, Eberspacher E, et al. The effect of the alpha 2-agonist dexmedetomidine and the N-methyldaspartate antagonist S(+)-ketamine on the expression of apoptosis-regulating proteins after incomplete cerebral ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 2003;96:524-31. pró-apoptóticas. A via Akt é essencial para a recuperação de IR renal. Neste estudo, como um indicador de apoptose, a imunorreatividade da caspase-3 foi avaliada. A ativacão da caspase-3 é o passo final da apoptose, que é comum às duas principais vías de apoptose e um indicador definitivo de morte celular. A administração de dexmedetomidina mostrou diminuir a imunorreatividade da caspase-3 ativa, mas não de modo significativo (p = 0,06), em comparação com a lesão de IR.

Essa diferença estatisticamente não significativa pode ser explicada pelo pequeño número de sujeitos do estudo. O pré-condicionamento isquêmico é um método aplicado mecânica ou farmacologicamente antes da isquemia do órgão-alvo para reduzir o nível subsequente da lesão de IR. O objetivo do pré-condicionamento isquêmico é aplicar isquemia e reperfusão de órgãos-alvo, em curtos intervalos de tempo, para garantir que o(s) órgão(s)-alvo pode(m) tolerar bem a isquemia. A grande demanda de energía e a intensa rede microvascular dos rins os tornam vulneráveis à lesão de IR, que é considerada uma das principais causas de lesão renal em estenose de artéria renal e cirurgia microvascular renal. A lesão de IR renal é a principal causa de morbidade e mortalidade cardiovascular e está associada ao atraso da função do enxerto pós-transplante e à ocorrência de lesão renal em cirurgia cardíaca e aórtica e à lesão renal pós-choque.1. Ojo AO, Wolfe RA, Held PJ, et al. Delayed graft function: risk factors and implications for renal allograft survival. Transplantation. 1997;63:968-74.4. Nigwekar SU, Kandula P, Hix JK, et al. Off-pump coronary artery bypass surgery and acute kidney injury: a meta-analysis of randomized and observational studies. Am J Kidney Dis. 2009;54:413-23.,3828 . Taoda M, Adachi YU, Uchihashi Y, et al. Effect of dexmedetomidine on the release of 3H]-noradrenaline from rat kidney cortex slices: characterization of alpha2-adrenoceptor. Neurochem Int. 2001;38:317-22.,3939 . Schrier RW, Wang W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 2004;351:159-69.

Estudos tanto experimentais quanto clínicos na literatura mostram que o PCI de órgão distante pode proteger o rim.4040 . Wever KE, Menting TP, Rovers M, et al. Ischemic preconditioning in the animal kidney, a systematic review and meta-analysis. PLoS ONE. 2012;7:e32296.,4141 . Venugopal V, Laing CM, Ludman A, et al. Effect of remote ischemic preconditioning on acute kidney injury in nondiabetic patients undergoing coronary artery bypass graft surgery: a secondary analysis of 2 small randomized trials. Am J Kidney Dis. 2010;56:1043-9. Semelhantemente ao nosso estudo, Wever et al., 4040 . Wever KE, Menting TP, Rovers M, et al. Ischemic preconditioning in the animal kidney, a systematic review and meta-analysis. PLoS ONE. 2012;7:e32296. investigaram o efeito do pré-condicionamento isquêmico direto (PCID) em extremidade posterior em lesão de IR renal. Em contraste, esses autores compararam o efeito da administração de PCID, contínua ou periodicamente, e também em uma ou duas extremidades. Embora tenham feito três ciclos de PCID, os investigadores usaram períodos i/R de 4/4minutos e investigaram os eventuais efeitos no minuto 25 de isquemia. Os autores relataram que a expressão da molécula-1, que indica lesão renal e tubular renal, diminuiu significativamente no grupo com três ciclos de i/R. Além disso, essa proteção não foi associada à adenosina, um dos elementos-chave na lesão de IR. O mecanismo subjacente do PCID e suas vías de transducão ainda não estão completamente esclarecidos. Ambas as vías de origem neural e transmissores bioquímicos podem desempenhar um papel no mecanismo do PCID.4242 . Curtis FG, Vianna PT, Viero RM. Dexmedetomidine and S(+)-ketamine in ischemia and reperfusion injury in the rat kidney. Acta Cir Bras. 2011;26:202-6. Esses mecanismos podem variar, a depender do órgão-alvo e do protocolo de pré-condicionamento aplicado. Nos métodos de isquemia miocárdica que usaram PCID renal, a expressão da proteína NF-κB seguida pela abertura dos canais de K+/ATP foi considerada importante.4343 . Diwan V, Kant R, Jaggi AS, et al. Signal mechanism activated by erythropoietin preconditioning and remote renal preconditioning-induced cardioprotection. Mol Cell Biochem. 2008;315:195-201.

Embora a lesão de IR renal seja um problema clínico comum e importante, as estratégias para reduzir a lesão de IR são insuficientes e novos tratamentos são necessários. Na literatura, não há relato sobre a protecção farmacológica e mecânica em lesão de IR renal em ratos.

Dois métodos diferentes usados em lesões de IR renal em ratos: dexmedetomidina, amplamente relatada como eficaz, e PCID, que demonstrou ser eficaz em alguns estudos,1111 . Tapuria N, Kumar Y, Habib MM, et al. Remote ischemic preconditioning: a novel protective method from ischemia reperfusion injury - a review. J Surg Res. 2008;150:304-30. foram combinados e comparados. Semelhantemente à dex-medetomidina, o uso combinado de dexmedetomidina e PCID impediu a lesão histopatológica e melhorou os escores da lesão de IR, exceto os escores de alterações tubulares, para níveis próximos ao grupo Sham. Ao mesmo tempo, a diminuição significativa da imunorreatividade da caspase-3, em comparação com o grupo IR, sugere que o uso combinado de dexmedetomidina e PCID pode prevenir a apoptose. O uso de dexmedetomidina pura diminuiu a imunorreatividade da caspase-3 ativa, ainda que não de modo significativo, o que sugere que esses dois métodos operam por meio das vías semelhantes. Esses dois métodos de proteção podem aumentar o efeito um do outro.

Em nosso estudo, usamos xilazina, um agente anestésico com atividade alfa-2-agonista, e cetamina,4242 . Curtis FG, Vianna PT, Viero RM. Dexmedetomidine and S(+)-ketamine in ischemia and reperfusion injury in the rat kidney. Acta Cir Bras. 2011;26:202-6. que sugeriram ter efeitos negativos sobre a lesão de IR. Os escores histo-patológicos e a imunorreatividade da caspase-3 ativa foram normais no grupo Sham, o que sugere que a cetamina não teve efeito negativo sobre os nossos resultados.

Não mostramos o efeito isolado do PCID em apoptose, que desempenha um papel fundamental no mecanismo da lesão de IR, o que constitui uma limitação do presente estudo. Outros fatores limitantes foram a não avaliação do estresse oxidativo e dos mediadores inflamatórios, que também são responsáveis pela lesão IR, e da via neurogênica.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Nov-Dec 2014

Histórico

  • Recebido
    04 Jul 2013
  • Aceito
    02 Jan 2014
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