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Discondroplasia tibial: mecanismos de lesão e controle

Tibial dyschondroplasia: mechanisms of the lesion and control

Resumos

A discondroplasia tibial (DT) é atribuída a uma assincronia no processo de diferenciação dos condrócitos, levando à formação de uma camada de condrócitos pré-hipertróficos e de uma cartilagem na tíbia proximal que não é calcificada, mas é resistente à invasão vascular. Além disso, tem sido proposto que, na discondroplasia tíbial, a etapa final do processo de calcificação não ocorre devido ao fato de que os efetores de alguns genes, relacionados com o mecanismo de calcificação do disco de crescimento podem apresentar algumas de suas propriedades químicas ou biológicas alteradas e/ou não serem expressos. Nesse sentido, a compreensão do mecanismo de ação e o papel das biomoléculas e dos minerais relacionados com a discondroplasia tibial poderão contribuir para o conhecimento de doenças do tecido ósseo e estabelecer estratégias de prevenção e tratamento.

calcificação; discondroplasia tibial; mineral; ossificação; endocondral


Tibial dyschondroplasia is attributed to an asynchrony of chondrocytes differentiation with the appearance of a layer of pre-hypertrophic chondrocytes and a non-calcified cartilage in the proximal growth plate in the tibia which is resistant to vascular invasion. It has been also proposed that in the tibial dyschondroplasia, the final step of calcification does not occur due to the effector of some genes, involved in the calcification mechanism in the growth plate, present their chemical and biological properties disrupted and does not express. Thus, the study of the mechanisms and biomolecules and minerals involved in the tibial dyschondroplasia process might contribute to the better knowledge of this disease and to stablish strategies of prevention and treatment.

calcification; endochondral; ossification; mineral; tibial dyschondroplasia


Discondroplasia tibial: mecanismos de lesão e controle

Tibial dyschondroplasia: mechanisms of the lesion and control

Pizauro Junior JMI, 1 1 Depto. de Tecnologia, FCAV/UNESP, Jaboticabal 2 Depto. de Química, FFCLRP/USP, Ribeirão Preto 3 Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal ; Ciancaglini PII, 2 1 Depto. de Tecnologia, FCAV/UNESP, Jaboticabal 2 Depto. de Química, FFCLRP/USP, Ribeirão Preto 3 Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal ; Macari MIII, 3 1 Depto. de Tecnologia, FCAV/UNESP, Jaboticabal 2 Depto. de Química, FFCLRP/USP, Ribeirão Preto 3 Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal

IDepto. de Tecnologia, FCAV/UNESP, Jaboticabal

IIDepto. de Química, FFCLRP/USP, Ribeirão Preto

IIIDepto. de Morfologia e Fisiologia Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal

Endereço para correspondência Endereço para correspondência João Martins Pizauro Júnior Depto. de Tecnologia, FCAV / UNESP Via de Acesso Profº Paulo Donato Castelanne, Km 5 14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil E-mail: jpizauro@fcav.unesp.br

RESUMO

A discondroplasia tibial (DT) é atribuída a uma assincronia no processo de diferenciação dos condrócitos, levando à formação de uma camada de condrócitos pré-hipertróficos e de uma cartilagem na tíbia proximal que não é calcificada, mas é resistente à invasão vascular. Além disso, tem sido proposto que, na discondroplasia tíbial, a etapa final do processo de calcificação não ocorre devido ao fato de que os efetores de alguns genes, relacionados com o mecanismo de calcificação do disco de crescimento podem apresentar algumas de suas propriedades químicas ou biológicas alteradas e/ou não serem expressos. Nesse sentido, a compreensão do mecanismo de ação e o papel das biomoléculas e dos minerais relacionados com a discondroplasia tibial poderão contribuir para o conhecimento de doenças do tecido ósseo e estabelecer estratégias de prevenção e tratamento.

Unitermos: calcificação, discondroplasia tibial, mineral, ossificação endocondral

ABSTRACT

Tibial dyschondroplasia is attributed to an asynchrony of chondrocytes differentiation with the appearance of a layer of pre-hypertrophic chondrocytes and a non-calcified cartilage in the proximal growth plate in the tibia which is resistant to vascular invasion. It has been also proposed that in the tibial dyschondroplasia, the final step of calcification does not occur due to the effector of some genes, involved in the calcification mechanism in the growth plate, present their chemical and biological properties disrupted and does not express. Thus, the study of the mechanisms and biomolecules and minerals involved in the tibial dyschondroplasia process might contribute to the better knowledge of this disease and to stablish strategies of prevention and treatment.

Keywords: calcification, endochondral ossification, mineral, tibial dyschondroplasia

INTRODUÇÃO

Nos vertebrados superiores, o processo de ossificação endocondral é o responsável pelo crescimento longitudinal da maioria dos ossos do esqueleto. Em circunstâncias normais, a calcificação ocorre no disco epifisário pela ação de células conhecidas como condrócitos, as quais se encontram em diferentes estágios de diferenciação, dependendo, principalmente, da sua localização no interior do disco de crescimento (Anderson, 1995; Gerber & Ferrara, 2000).

O disco de crescimento (Figura 1) é composto de cartilagem, formando uma estreita faixa de ligação (0,5 a 1 mm) entre a epífise e a diáfise, e pode ser dividido em várias regiões anatômicas: a) zona de reserva, que contém condrócitos aparentemente dispersos e inativos; b) zona de proliferação, onde a maioria das divisões celulares ocorrem. Essa região contém as células precursoras dos condrócitos (células progenitoras) em forma de disco. O nascimento de células jovens que se diferenciam em condrócitos acarreta um acúmulo de novas células que são deslocadas para baixo, formando uma coluna ao longo da zona proliferativa. A formação dessa coluna permite a subdivisão da matriz em septo transversal, que separa as colunas de células em diferentes estágios, e em septo longitudinal, que separa as colunas de células adjacentes. O tempo de vida de um condrócito, entre o seu nascimento na zona proliferativa e morte na zona hipertrófica, é de aproximadamente três (3) dias em aves de crescimento rápido; c) a zona de maturação, é a região onde os condrócitos passam de uma fase de pós-divisão a um estado de maturação. O estado de maturação é caracterizado por uma fase de intensa síntese e secreção de matriz, e é nesse local onde aparece a enzima fosfatase alcalina. A zona hipertrófica, contém condrócitos aumentados e muitas vesículas da matriz. Finalmente, existe a zona de calcificação, onde os condrócitos sofrem degeneração. É nessa região que ocorre o depósito de fosfato de cálcio no interior das vesículas, que posteriormente se extravasa infiltrando nos interstícios do septo longitudinal.


O crescimento longitudinal do osso ocorre através do equilíbrio preciso entre a proliferação dos condrócitos, produção de matriz óssea, calcificação biológica, hipertrofia e invasão vascular da lacuna do condrócito hipertrofiado. Assim, a diferenciação dos condrócitos é a etapa crucial do processo de ossificação endocondral (Anderson, 1995; Gerber & Ferrara, 2000; Farquhason & Jeferreis, 2000; Jeferreis et al., 2000; Loveridge et al., 1993). Segundo Brighton (1987) e Howlett (1979), os condrócitos adquirem uma série de fenótipos durante os estágios proliferativo, pré-hipertrófico e hipertrófico, antes de atingirem os estágios finais de morte celular, sugerindo que a etapa final de diferenciação dos condrócitos no disco de crescimento possui um papel central no processo de ossificação endocondral (Pines et al., 1998; Loveridge et al., 1993; Gerber & Ferrara, 2000; Farquharson & Jeffreis, 2000; Praul et al., 2000)

O papel dos condrócitos no disco de crescimento é fascinante devido, principalmente, ao fato de que seu período de vida é sincronizado no tempo e no local onde sua atividade é requerida. O acúmulo de resultados experimentais, ao longo desses últimos anos, tem mostrado que a hipertrofia dos condrócitos é etapa essencial para invasão vascular e, subseqüente, substituição da matriz calcificada por osso (Gerber & Ferrara, 2000), sugerindo que a vascularização da região inferior do disco de crescimento representa uma etapa crucial na interação entre os processos de condrogênese (produção de cartilagem) e osteogênese (formação do tecido ósseo), principalmente durante o período de crescimento rápido dos ossos longos ou reparo de fraturas (Gerber & Ferrara, 2000). Mudanças nesse equilíbrio pode levar ao desenvolvimento de doenças esqueléticas, tais como osteoartrite, calcificação ectópica e discondroplasia.

Estudos recentes mostraram que, no caso da discondroplasia tibial, as lesões contem altos níveis de condrócitos pré-hipertróficos e ausência de células hipertróficas, sugerindo que a etapa final do processo de calcificação não aconteceu devido à presença de células que não expressaram, ou possuem baixo nível de expressão, dos genes responsáveis pela hipertrofia dos condrócitos (Pines et al., 1998). Além disso, tem sido sugerido que a formação de estruturas vasculares e a calcificação da cartilagem estão intimamente associadas com o desenvolvimento de patologias. Na tentativa de explicar essas patologias, alguns autores admitem que a invasão vascular da cartilagem está associada à apoptose dos condrócitos e, conseqüentemente, à inibição das etapas finais do processo de calcificação biológica (Anderson, 1995, Gerber Ferrara, 2000; Farquharson & Jeffreis, 2000). Apoptose, ou morte programada da célula, é atualmente reconhecida como um fenômeno biologicamente útil que acontece na maioria tecidos que exibem crescimento ordenado. Assim sendo, um atraso na apoptose dos condrócitos pode resultar em um acúmulo de células hipertrofiadas no disco de crescimento. Logo, o estudo dos processos que regulam a maturação do condrócito poderá contribuir para a compreensão do(s) mecanismo(s) responsável(eis) pelo desenvolvimento da lesão. A morte programada dos condrócitos no disco de crescimento de ossos longos tem sido muito estudada nos últimos anos (Clarke & Clarke, 1996), e os resultados obtidos mostraram que existe uma estreita relação entre a vascularização da cartilagem e a morte programada dos condrócitos hipertróficos (Floyd et al., 1987). De fato, tem sido demonstrado que a vascularização e a reabsorção da cartilagem calcificada ocorre após a apoptose dos condrócitos (Gibson et al., 1995, 1997, 2001), e que a invasão vascular pode eliminar, de cada coluna de células, um condrócito hipertrófico a cada 3 horas, ou 8 células em um dia (Hunziker et al., 1987), sugerindo que a morte dos condrócitos (apoptose) coincide com a sua hipertrofia e não depende de estímulos externos (Gibson et al., 1997).

Outro aspecto a ser considerado é que o processo de ossificação endocondral pode ser reproduzido experimentalmente in vivo através do implante de matriz óssea desmineralizada (Reddi & Huggins, 1972), ou pelo implante de proteína morfogênica, extraída do tecido ósseo, no tecido subcutâneo de ratos (Urist et al., 1973), ou ainda, pelo implante de proteína morfogênica ou matriz óssea desmineralizada associada com plasma enriquecido em plaqueta (Marx et al., 1998). Reddi & Huggins (1972) demonstraram que o implante de matriz óssea desmineralizada, em tecido subcutâneo de ratos, age como um estímulo que desencadeia um processo de diferenciação e organização celular, levando à formação seqüencial de cartilagem e osso. Os aspectos histológicos e bioquímicos envolvidos no processo de calcificação ectópica dessas placas, via ossificação endocondral, foram estudados por esses mesmos autores, que observaram uma estreita correlação entre a atividade da fosfatase alcalina com os sítios histológicos de formação do tecido ósseo. A principal característica desse método é o fato de que as enzimas envolvidas no processo de calcificação biológica podem ser estudadas em diferentes etapas do processo de ossificação endocondral, tanto em condições normais como patológicas (Leone et al., 1997). No que tange ao uso de plasma enriquecido de plaqueta (PRP), tem sido demonstrado que a adição desse plasma acelera o processo de deposição do tecido ósseo e melhora a qualidade de regeneração do tecido implantado. A teoria mais aceita, atualmente, é que o uso do PRP, juntamente com matriz óssea desmineralizada ou proteína morfogênica, estimula o processo de ossificação endocondral e até mesmo pode acelerar o processo regenerativo do tecido ósseo. As aplicações clínicas de componente derivado do sangue sugere que o uso de PRP parece prover biomoléculas e fatores de crescimento e de diferenciação celular que conduzem a regeneração mais rápida e efetiva do tecido lesionado.

CALCIFICAÇÃO

Atualmente, admite-se que o brotamento das vesículas de matriz representa um intrigante mecanismo de geração de organelas extracelulares, cuja função é a de realizar as etapas finais do processo de calcificação antes da morte programada da célula por apoptose (Kirsch & Wuthier, 1994; Anderson, 1995).

Os eventos bioquímicos e biofísicos, responsáveis pela biogênese das vesículas extracelulares, ainda não estão perfeitamente elucidados, mas admite-se que eles estejam relacionados com o ciclo de vida dos condrócitos e, possivelmente, com o seu processo de apoptose (Kerr et al., 1972; Anderson, 1995).

Um dos grandes desafios da biologia é a compreensão de como as células se replicam e se dividem, e um dos aspectos importantes desse problema é saber como as células formam as vesículas extracelulares. A nova vesícula deve ser formada com grande precisão e possuir todas as informações necessárias para criar um microambiente adequado para a formação e preservação de mineral de hidroxiapatita (Anderson, 1995).

As vesículas surgem por brotamento das superfícies laterais dos condrócitos (Figura 2) e são secretadas no local específico do início da calcificação da matriz do tecido ósseo. Nos osteoblastos, as vesículas surgem da membrana plasmática adjacente à matriz óssea recentemente formada. Nos odontoblastos, as vesículas surgem na porção apical da célula que se encontra em contato com a matriz da pré-dentina.


O papel dessas vesículas como mediadoras da deposição mineral é fortemente sugerido pelos seguintes fatos: o local de aparecimento de depósitos minerais tem exata correspondência com o local das vesículas (Anderson, 1973; Ali, 1976; Martino et al., 1979); os primeiros cristais (Figura 2) na forma de pequenas agulhas ou de bastão, que precedem o crescimento do cristal extracelular, têm sido detectados dentro dessas vesículas (Bonucci, 1971; Ali & Evans, 1973; Anderson, 1973, 1976; 1995; Wuthier, 1977; Sela et al., 2000). Além disso, tem sido proposto que o interior das vesículas também serve como um microambiente selado, que protege o primeiro núcleo do mineral, enquanto ainda está em um estado pré-cristalino mais solúvel, antes de se converter em um cristal de hidroxiapatita. Tem sido verificado, ainda que as vesículas isoladas também possuem a capacidade de depositar sais de cálcio in vitro (Ali & Evans, 1973; Hsu & Anderson, 1977, 1978, 1986; Register et al., 1984; Wuthier & Register 1985).

Se a hipótese acima for correta, então genes que são normalmente expressos nos condrócitos hipertróficos deveriam mostrar expressão reduzida, ou os efetores de alguns genes relacionados com o mecanismo de calcificação do disco de crescimento poderiam apresentar algumas de suas propriedades químicas ou biológicas alteradas. Nesse contexto, Nie et al. (1995) demonstraram que as vesículas extracelulares isoladas de aves com discondroplasia tibial são inativas e não conseguem iniciar o processo de calcificação biológica. Segundo esses autores, existe um defeito na vascularização do tecido, onde o fornecimento de minerais e nutrientes necessários para a cartilagem é inadequado para suportar a formação de vesículas extracelulares normais, necessárias para iniciar o processo de calcificação biológica.

Por outro lado, Laureano et al. (2002) vertificaram que os estudos das propriedades cinéticas da fosfatase alcalina extraída do disco de crescimento, e purificada por centrifugação diferencial, de aves normais e de aves acometidas de lesão mostraram que nenhum dos parâmetros estudados (atividades de p-nitrofenilfosfatase, de ATPase e de pirofosfatase, efeito do pH e ação de inibidores) apresentaram algum resultado que pudesse sugerir alguma modificação no comportamento cinético da enzima, sugerindo que a discondroplasia tibial não pode ser atribuída à alteração da(s) propriedade(s) da fosfatase alcalina, mas pode ser atribuída a mecanismos e/ou defeito(s) mais complexo(s).

Papel do pirofosfato

Estudos efetuados por pesquisadores para determinar os tipos de lipídios, de eletrólitos e, principalmente, as enzimas presentes nas vesículas extracelulares, têm revelado que a fosfatase alcalina não é a única enzima importante para o processo de calcificação biológica presente na membrana (Anderson, 1995; Hsu, 1994; Pizauro et al., 1998). Dentre elas, tem sido demonstrado a presença de elevados níveis de pirofosfatase, de adenosina-5'-trifosfatase (Pizauro et al., 1998; Hsu & Anderson, 1995) e da ectoenzima fosfodiesterase nucleotídeo pirofosfatase (PC-1) (Caswell et al., 1986; Johnson et al., 2000; Gijsbers et al., 2001). Segundo Johnson et al. (1999, 2000) e Gijsbers et al. (2001), a ectoenzima fosfodiesterase nucleotídeo pirofosfatase (PC-1) utiliza o ATP presente no fluido extracelular da cartilagem para gerar o substrato da ectofosfatase alcalina (Figura 3), o pirofosfato inorgânico (PPi).


Além disso, já foi demonstrado que a fosfatase alcalina também pode hidrolisar o ATP, liberando o fosfato inorgânico. A enzima é regulada alostericamente pelo ATP (Pizauro et al., 1993) e inibida competitivamente pelo produto da reação, o fosfato inorgânico (Pizauro et al., 1987), sugerindo que os níveis relativos de PPi, um inibidor da calcificação, e de Pi, um inibidor da fosfatase alcalina, presentes no fluído extracelular da matriz, também desempenham um papel importante na regulação do processo de calcificação biológica. Essa hipótese é suportada pela recente demonstração de que o nível do fosfato inorgânico, derivado da hidrólise do PPi pela fosfatase alcalina, atua como um sinal da indução da expressão da glicoproteína fosforilada osteopontina em osteoblastos (Bek et al., 2000).O pirofosfato inorgânico (PPi) participa da regulação de vários eventos intracelulares e extracelulares de uma grande variedade de tecidos, sugerindo que a regulação da sua síntese, degradação e transporte ocorre por meio de mecanismos altamente especializados. O papel fisiológico do pirofosfato extracelular tem sido muito estudado nos últimos anos, principalmente em relação ao processo de calcificação biológica. A compreensão dos eventos que participam da síntese e do metabolismo do pirofosfato no tecido ósseo pode contribuir para elucidar sua participação no processo de calcificação. O pirofosfato é um potente inibidor da mineralização biológica, da formação de "pedra" nos rins e em outros fluidos extracelulares (Anderson et al., 1997; Fleisch & Russel 1972; Galperin et al., 1998; Johnson et al., 1999; Johnson et al., 2000; Krug et al., 2000; Okawa et al., 1998; Rutsch et al., 2001; Wuthier et al., 1972). Além disso, tem sido verificado que o pirofosfato inibe a capacidade dos condrócitos de depositar minerais diretamente (especificamente cristais de hidroxiapatita e de fosfato de cálcio básico) na matriz pericelular do tecido ósseo (Johnson et al., 1999; 2000; Poole et al., 1989). Especula-se, ainda, que a remoção e/ou a degradação do pirofosfato é necessária para destruir seu efeito inibitório da calcificação biológica mediada pelas vesículas extracelulares (Meyer, 1984; Rezende et al., 1999; Anderson 1995; Anderson et al., 1997; Leone et al., 1997). Por outro lado, a propagação dos cristais de hidroxiapatita fora das vesículas extracelulares também é inibida pelo PPi (Anderson, 1995). Assim, o pirofosfato pode representar a molécula sinal responsável pelo controle da calcificação, tanto em condições normais, como em condições patológicas (Terkeltaub, 2001), sugerindo que o aumento da concentração extracelular do inibidor natural da formação da hidroxiapatita e da mineralização bloqueia a calcificação da cartilagem articular e de outros tecidos. Assim, a compreensão dos mecanismos envolvidos na sua síntese, pela enzima ATP-pirofosfohidrolase, também conhecida por PC-1, e dos mecanismos envolvidos na regulação da sua concentração no tecido ósseo, pelas enzimas fosfatase ácida e fosfatase alcalina, poderá contribuir para a compreensão da discondroplasia tibial. Essa hipótese é suportada pela demonstração de que ratos transgênicos deficientes de fosfatase ácida também apresentam cartilagem não vascularizada (Hayman et al., 1996). Tem sido demonstrado, ainda, que ratos cujo gene da metaloproteinase-9 da matriz foi nocauteado apresentam cartilagem semelhante àquela encontrada na discondroplasia (Vu et al., 1998), sugerindo que os osteoclastos também desempenham um papel importante no processo de vascularização da porção terminal distal do disco de crescimento e reabsorção da cartilagem calcificada (Praul et al., 2000).

DISCONDROPLASIA TIBIAL

Apesar da discondroplasia tibial merecer atualmente a atenção de inúmeros pesquisadores, os eventos químicos e biológicos envolvidos nesse processo ainda não estão perfeitamente elucidados. Na tentativa de explicar esse mecanismo, alguns autores admitem que o estímulo mecânico juntamente com o genótipo e alterações nos constituintes da dieta podem interromper os eventos envolvidos no processo de diferenciação dos condrócitos e desencadear o processo de formação da lesão (Edwards, 2000; Praul et al., 2000; Farquharson & Jeffereis, 2000, Rath et al., 1998; Velleman, 2000; Reddi, 2000). De fato, estudos realizados por vários pesquisadores mostraram que a interrupção do processo de diferenciação dos condrócitos leva à formação de uma camada de condrócitos pré-hipertróficos e de uma matriz óssea que não é calcificada e resistente à invasão vascular (Edwards, 2000; Praul et al., 2000; Farquharson & Jeffereis, 2000; Rath et al., 1998; Velleman, 2000; Reddi, 2000). Como os condrócitos continuam a proliferar-se normalmente, ocorre um acúmulo de condrócitos pré-hipertróficos e a lesão aumenta em tamanho (Figura 4). Nessas condições, o fornecimento de nutrientes e de oxigênio aos condrócitos localizados no interior da lesão é inadequado, o que resultaria em maior morte celular por apoptose (Praul et al., 2000). Alguns autores admitem ainda, que a etapa final do processo de calcificação não acontece, devido ao fato de que os efetores de alguns genes relacionados com o mecanismo de calcificação do disco de crescimento de aves podem apresentar algumas de suas propriedades alteradas e/ou não serem expressos.


Estudos recentes mostraram que o estresse celular também pode desencadear o processo de apoptose, e que as células respondem ao estresse aumentando a expressão de "chaperones" moleculares, também conhecidos como proteína de choque térmico (Hsp70), a fim de aumentar a habilidade da célula em suportar condições letais de estresse (Kaarniranta et al., 1998; Ohtsuka & Hata, 2000; Mosser et al., 2000). Um outro aspecto interessante que merece ser destacado é que a Hsp70 inibe a apoptose prevenindo a liberação do citocromo c da mitocôndria e o processamento da pró-caspases 9 e 3, sugerindo que o aumento da expressão da Hsp70 é essencial para inibir o processo de apoptose induzido pelo estresse (Mosser et al., 2000).

Apoptose dos condrócitos

Durante o processo de ossificação endocondral, os condrócitos passam por vários estágios de diferenciação celular e, finalmente, apresentam sinais morfológicos de morte celular (Clarke & Clarke, 1996). Atualmente, tem sido proposto que os eventos morfológicos que acontecem no disco epifisário da cartilagem em crescimento representa um modelo interessante de apoptose. O termo apoptose foi introduzido por Kerr et al. (1972) para descrever um tipo de morte celular que exibe um conjunto distinto de características morfológicas e bioquímicas. Esse processo contrasta com necrose, na qual a morte celular é secundária a diversos danos celulares. Muitos exemplos de apoptose, mas não todos, representam uma verdadeira morte celular programada (Martin et al., 1994). Além disso, estudos recentes mostram que o estresse celular pode desencadear o processo de morte celular, e que as células respondem ao estresse aumentando a expressão de "chaperones" moleculares a fim de aumentar a habilidade da célula em suportar condições letais de estresse (Mosser et al., 2000).

Vanmuylder et al. (1997) admitem que a expressão das proteínas de estresse (Hsps) podem estar envolvidas com a apoptose dos condrócitos e possuem uma função importante no processo fisiológico de morte celular dessas células. É proposto, também, que os "chaperones" moleculares parecem ter a capacidade de modular o processo de morte celular em culturas de tecido ósseo, resultando em reabsorção da matriz calcificada. Segundo Nair et al. (1999), os prostanóides e o óxido nítrico, que são reguladores da remodelação óssea, também podem participar do processo de regulação da síntese de "chaperones".

Em relação aos eventos envolvidos no processo de discondroplasia tibial, há evidências de que a apoptose é mínima, sugerindo que ocorre uma alteração no processo de morte celular programada, resultando em um tecido que contém células imaturas que sobreviveram mais que o seu tempo de vida normal (Ohyama et al., 1997). Por outro lado, Praul et al. (1997) relataram que na discondroplasia tibial as células apresentam características morfológicas de células necróticas e até mesmo de células apoptóticas, sugerindo que a apoptose observada nessa lesão é um efeito secundário e não a causa primária da doença.

Assim, a identificação dos genes expressos (ESTs) relacionados com os mecanismos moleculares, que participam dos processos envolvidos na calcificação da cartilagem em condições patológicas, como a discondroplasia, pode fornecer dados que possam, ulteriormente, serem utilizados em estudos moleculares e estabelecer estratégias de ajuda para o tratamento de doenças desse tecido.

Vitaminas D, A e C

A vitamina D consiste em um grupo de moléculas semelhantes aos esteróides denominadas de secosteróides, dentre os quais, o colicalciferol (Vitamina D3) e o ergosterol (Vitamina D2) são os compostos que participam da regulação do desenvolvimento do tecido ósseo, do metabolismo e da homeostase do cálcio (Bortman et al., 2002; Farquharson & Jeffereis, 2000). Nas aves, a vitamina D3 é cerca de 30 a 40 vezes mais potente do que a vitamina D2. A vitamina D pode ser obtida pela alimentação ou ser produzida pelo organismo, desde que haja luz suficiente. Vários estudos mostram que, teoricamente, a síntese endógena deveria fornecer vitamina D3 suficiente para prevenir raquitismo e maximizar o crescimento de frangos de corte expostos à luz solar por um período compreendido entre 11 e 45 minutos por dia. A vitamina D3 pode ser sintetizada por uma via endógena na qual o precursor 7-deidrocolesterol, que ocorre naturalmente nas camadas epidérmicas, pode ser convertido em pré-vitamina D, na lâmina de Malpigi, pela irradiação da luz ultravioleta. À temperatura corporal, cerca da metade da pré-vitamina D produzida na pele, é convertida espontaneamente em vitamina D3, por dia. A vitaminas D2 e D3 são inativas e suas formas ativas são produzidas pelas hidroxilação (adição de hidroxila) enzimática realizada no fígado e nos rins, produzindo a 25-(OH)D3 e 1a,25-(OH)2D3 respectivamente. Assim, a pré-vitamina D3 permanece na pele enquanto que a vitamina D3 é transportada da pele ou do intestino para o fígado, ligada a uma proteína ligadora de vitamina D, onde é hidroxilada na posição 25, formando o 25(OH)D3. O 25(OH)D3 entra na circulação onde é a principal forma de vitamina D encontrada no plasma, sendo transportada aos rins também ligada à proteína ligadora de vitamina D, onde sofre hidroxilação na posição 1 formando o 1,25(OH)2D3 que é o metabólito natural mais potente da vitamina D. As necessidades nutricionais de vitamina D3 para frangos é expressa em unidade internacional (ICU ou International Chick Units), para diferenciá-la da vitamina D total e da vitamina D2.

A forma ativa da vitamina D, a 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25-(OH)2D3), é um importante regulador do desenvolvimento do tecido ósseo, do metabolismo e da homeostase do cálcio. Além disso, a 1,25-(OH)2D3 possui também um papel importante na regulação do crescimento e diferenciação das células do tecido ósseo ( Whitehead, 2002).

A vitamina D é um hormônio cuja transdução de sinal pode ser desencadeada pela ligação a um receptor localizado na membrana plasmática (mVDR) e/ou no núcleo (nVDR) (Farquharson & Jeffereis, 2000; Bortman et al., 2002; Revelli et al., 1998). Algumas evidências experimentais suportam a hipótese de que também pode existir uma inter-relação entre a resposta gênica e a resposta não-gênica operando no mesmo tipo de célula.

Em relação ao seu mecanismo de ação no núcleo da célula, tem sido demonstrado que o hormônio atravessa a membrana celular por difusão passiva e liga-se ao receptor nuclear que se heterodimeriza. O heterodímero formado migra para o núcleo onde estimula a atividade da enzima, RNA polimerase II, responsável pela síntese de RNAm de proteínas alvos e, conseqüentemente, novas mensagens serão transcritas em proteínas específicas.

O mecanismo de ação não-genômico da vitamina D envolve a ligação do hormônio a receptores extracelulares. Esses receptores ativam a cascata da adenil ciclase-AMPc-proteína quinase e do fosfatidilinositol, resultando em abertura de canais de cálcio, que disparam vários processos celulares. Finalmente, a inter-relação entre as duas respostas, gênicas e membranar, seria a ativação de proteínas alvos no citoplasma e no núcleo. Um dos possíveis candidatos é o receptor nuclear da 1,a25-(OH)2D3 e as proteínas regulatórias envolvidas na modulação da transcrição gênica induzida. O seu uso, na avicultura, tem despertado um grande interesse por parte dos pesquisadores nos últimos anos devido, principalmente, à sua capacidade de estimular a diferenciação dos condrócitos, regularizar o crescimento ósseo, prevenir o raquitismo e diminuir a incidência da discondroplasia tibial (Throp et al., 1993; Roberson & Edwards, 1994; Rennie & Whitehead, 1996; Kilburn & Edwards, 2001). Estudos recentes indicam que a exigência quantitativa para colicalciferol (vitamina D3) pelas aves jovens varia de 275 ICU (6,9 mg/kg) para o crescimento, 503 ICU (10,1 mg/kg) para aumentar o conteúdo de cinzas dos ossos, 552 ICU (13,8mg/kg) para aumentar a quantidade de cálcio do sangue e 904 ICU (22,6 mg/kg) para prevenir o raquitismo (Baker et al., 1998; Kilburn & Edwards, 2001; Edwards et al., 1996; Edwards, 2000). Estudos mostram que a adição da vitamina 1,25(OH)2D3 a dietas adequadas ou desbalanceadas de cálcio e fósforo reduz a incidência de discondroplasia tibial, aumenta a absorção de cálcio e o conteúdo de cinzas dos ossos (Rennie et al., 1993; Edwards, 1989; Kilburn & Edwards, 2001). Tem sido verificado, ainda, que a adição da 1,25(OH)2D3 a dieta balanceada de cálcio e fósforo também reduz a incidência de discondroplasia tibial durante o período de crescimento das aves (Xu et al., 1997; Kilburn & Edwards, 2001), sugerindo que a forma 1,25(OH)2D3 da vitamina D é um hormônio chave na homeostase do cálcio, controlando diretamente a absorção do cálcio dietético no intestino, a reabsorção óssea e influenciando a reabsorção do cálcio nos túbulos proximais dos rins (Norman, 1979). Além disso, tem sido demonstrado, também, que a 1,25(OH)2D3 e a 24,25 (OH)2D3 são requeridas para a síntese do peptídeo C-teminal do colágeno do tipo II (Hinek & Poole, 1988). A 24,25(OH)2D3 é necessária para a expressão máxima da atividade da fosfatase alcalina de cartilagem e osso (Shwarts et al., 1998) e da proteína ligadora de cálcio no disco de crescimento das aves (Xu et al., 1998).

O acúmulo de resultados experimentais, ao longo desses últimos anos, tem mostrado que a vitamina D é essencial ao processo de condrogênese (produção de cartilagem) e osteogênese (formação do tecido ósseo), principalmente durante o período de crescimento das aves (Xu et al., 1998; Edwards, 2000). Entretanto, o mecanismo pelo qual a vitamina D previne a discondroplasia tibial foi e continua sendo um assunto bastante controvertido. Tem sido proposto que a vitamina D exerce um papel direto na regulação do metabolismo dos condrócitos (Sylvia et al., 2001; Xu et al., 1998; Suda, 1985). Essa hipótese é suportada, principalmente, pela recente demonstração de que o seu uso como suplemento dietético é essencial para promover diferenciação dos condrócitos, bem como normalizar o crescimento no interior do disco de crescimento e prevenir discondroplasia tibial. Entretanto ainda não está perfeitamente esclarecido porque as aves de crescimento rápido necessitam de altos níveis exógenos de vitamina D para prevenir a discondroplasia tibial, sugerindo que, nas aves de crescimento rápido, a síntese endógena pelos rins é deficiente, e não consegue manter os níveis ideais de vitamina D, necessários para o processo de ossificação endocondral. Essa suposição é suportada pelo fato de que aves que possuem maior predisposição para desenvolver a lesão apresentam baixas concentrações plasmáticas de vitamina D, embora as concentrações circulantes de 1,25(OH)2D3 em pintos portadores de discondroplasia tibial sejam normais.

Outra possibilidade que não pode ser descartada seria uma alteração local na concentração dos metabólitos da vitamina D. Alguns autores admitem, ainda, que os condrócitos localizados no interior da lesão possuem menor número de receptores nucleares, e que os receptores dessas células também possuem uma baixa afinidade pelo ligante, o que poderia explicar a necessidade de altas concentrações de 1,25(OH)2D3, a fim de se alcançar efeitos normais (Xu et al., 1998). Entretanto, ainda não é conhecido se a vitamina previne a discondroplasia tibial induzindo a síntese de receptores nucleares.

Existem evidências, também, de que a discondroplasia tibial poderia ser atribuída a uma diminuição da síntese de uma proteína ligadora de cálcio intestinal e, subseqüente diminuição do cálcio circulante (Haussler & McCain, 1977a,b). Entretanto esse parece não ser o caso uma vez que os níveis normais de cálcio e de fósforo necessários para a calcificação têm sido encontrados no disco de crescimento de animais com discondroplasia tibial. Recentemente, Xu et al. (1998) demonstraram que na discondroplasia tibial os condrócitos apresentam uma diminuição na expressão do gene da proteína ligadora de cálcio.

Tem sido proposto, ainda, que a discondroplasia tibial não está associada com um aumento nos condrócitos ou diminuição da reabsorção da cartilagem (Farquharson et al., 1993), mas sim com fatores que regulam a diferenciação dos condrócitos (Rennie et al., 1993; Farquharson et al., 1995; Whitehead, 2002). Essa hipótese é suportada pelo fato de que a suplementação dietética de 1,25-dihidroxicolecalciferol para aves normais resulta em estímulos da diferenciação de condrócitos e, particularmente, aumento da atividade da fosfatase alcalina (Farquharson et al., 1992).

Estudos recentes têm demonstrado a presença de receptores funcionais para os metabólitos 1,25-(OH)2D3 e 24,25-(OH)2D3 na membrana das vesículas extracelulares isoladas do disco de crescimento (Nemere et al., 1998; Pedrozo et. al., 1999). O mecanismo de sinalização desses receptores inclui a participação da proteína quinase C (Sylvia et al., 1997; 2001), a fosfolipase A2 (Schwartz & Boyan, 1988; Sylvia et al., 1998) e de prostaglandinas (Schwartz et al., 1992; Sylvia et al., 2001). O efeito final da interação desses metabólitos com os receptores é a modulação das enzimas envolvidas na calcificação biológica, a fosfatase alcalina, e enzimas proteolíticas, tais como a metaloproteases, colagenases e estromelisina que participam da degradação e da renovação das proteoglicanas e do colágeno.

O mecanismo de controle da mineralização, mediado pelas vesículas extracelulares, inclui efeitos na liberação das vesículas pela 1,25 dihidrovitamina D3, ativação de proteína quinase e apoptoses. Além disso, a composição da vesícula da matriz e o seu potencial de mineralização podem ser regulados por hormônios calciotrópicos e citocininas. Alterações no microambiente das vesículas também podem influenciar o seu potencial de iniciar a calcificação e a propagação extravesicular do mineral (Sylvia et al., 2001).

Resultados contraditórios têm sido publicados sobre o efeito da vitamina D na concentração da fosfatase alcalina circulante. Segundo Roberson & Edwards (1994), o nível de fosfatase alcalina circulante não é afetado pelo uso da vitamina D na alimentação. Apesar dessas contradições, alguns autores admitem, ainda, que a vitamina D poderia aumentar a expressão de uma fosfatase alcalina intestinal, que poderia atuar como uma fosfotransferase e favorecer a translocação do fosfato, e de outras proteínas que são reguladas pela proteína ligadora de cálcio.

Em relação ao papel da vitamina A, alguns estudos indicam que concentrações elevadas dessa vitamina, na dieta, interfere na absorção de vitamina D, no intestino, pois ambas competem pelo mesmo sítio de absorção (Veltmann et al., 1986). Além disso, resultados contraditórios tem sido obtidos, utilizando-se altos níveis de vitamina A na dieta sobre a incidência de discondroplasia, alguns autores demonstram que níveis elevados podem reduzir a incidência, enquanto outros indicam que existe uma exacerbação do processo (Veltmann et al., 1986; Ballard & Edwards, 1998).

Britton (1992) estudou os efeitos causados por um excesso de vitamina A na dieta de frangos, utilizando-se de três níveis de vitamina A e dois de vitamina D nas rações, e concluiu que a severidade da discondroplasia aumentou nas aves alimentadas com ração deficiente em vitamina D e com os maiores níveis de vitamina A. Resultados semelhantes foram obtidos por Luo & Huang (1991), que pesquisaram a interação das vitaminas A e D sobre o desempenho, incidência e severidade da discondroplasia em frangos. Trabalhos com perús demonstram que níveis dietéticos de 13.200 mg de vitamina A/kg podem reduzir a taxa de crescimento e evidenciar sintomas clínicos de raquitismo (Stevens et al., 1983).

O ácido ascórbico, ou vitamina C, é essencial para a formação do colágeno e sua deficiência resulta na síntese de molécula de colágeno instável, caracterizada por uma matriz extracelular anormal e interrupção da ossificação endocondral. O colágeno é a molécula orgânica, que confere força e estabilidade à cartilagem do disco de crescimento (Farquaharson & Jeffereis, 2000), e sua estabilidade depende da hidroxiprolina para formar pontes de hidrogênio intercadeias (Jimenez et al., 1973).

A vitamina C é o cofator das enzimas prolil e lisil hidroxilase que participam do processo de modificação pós-transcricional, levando à formação da forma estável do colágeno (Hausmann, 1967; Hutton et.al., 1967; Kivikko & Prochop, 1967, 1972). O ácido ascórbico também estimula outras reações de hidroxilação, inclusive a da hidroxilase que converte 25-(OH)2D3 em 1,25-(OH)2D3 (Farquharson & Jeffereis, 2000). Entretanto ainda não está perfeitamente esclarecido se o ácido ascórbico e a vitamina D (metabólito 1,25-(OH)2 D3) apresentam ação sinergística na prevenção da discondroplasia tibial, participando da modulação e da regulação da composição da matriz óssea secretada no disco de crescimento e da diferenciação dos condrócitos.

Estudos in vitro mostram que a adição de ácido ascórbico ao meio de cultivo facilita a diferenciação dos condrócitos (Monsonego et al., 1997), aumentando a atividade da fosfatase alcalina e a síntese de osteopontina (Beck et al., 2000). Segundo esses autores, o ácido ascórbico é um indutor importante de diferenciação de osteoblastos, estimulando a secreção de matriz extracelular rica em colágeno e de efetores gênicos específicos tais como: fosfatase alcalina, osteocalcina e osteopontina. A osteopontina é uma glicoproteína fosforilada secretada na matriz extracelular pelos osteoblastos, durante o desenvolvimento do tecido ósseo. Em relação à sua função, admite-se que a ostepontina facilita a ligação dos osteoblastos e dos osteoclastos à matriz extracelular, permitindo assim que tais células desempenhem suas respectivas funções durante a osteogênesis.

Segundo Farquharson et al. (1998) o ácido ascórbico, in vitro, além de atuar como um sinal estimulador da síntese de fosfatase alcalina, também aumenta o número de receptores da 1,25-(OH)2D3 dos condrócitos. Como o número de receptores dos condrócitos, localizados no interior da lesão está reduzido (Berry et al., 1996), tem sido proposto que o ácido ascórbico, juntamente com 1,25-(OH)2D3, pode desempenhar, em nível celular, um papel importante na regulação do desenvolvimento da discondroplasia tibial. Entretanto as diferentes condições experimentais utilizadas no estudo do efeito da vitamina C na discondroplasia tibial têm levado à publicação de resultados contraditórios, o que tem dificultado a elucidação da possível eficácia dessa vitamina na prevenção do desenvolvimento da lesão.

Weiser (1988) verificou que a adição de vitamina C na dieta animal resulta em aumento da proteína ligadora de cálcio duodenal e do metabólito 1,25-dihidroxicolecalciferol (1,25-(OH)2D3) plasmático, sugerindo que a vitamina C provoca um aumento da atividade da hidroxilase que converte 25-(OH)2D3 em 1,25-(OH)2D3. Por outro lado, Edwards (1989) não observou nenhuma interação entre o ácido ascórbico e o colecalciferol no crescimento, na quantidade de cinzas do tecido ósseo, ou na prevenção da discondroplasia tibial.

Estudos mostraram que a suplementação de ácido ascórbico à dieta normal não previnem a discondroplasia tibial em aves, embora Whitehead et al. (1994) tenham demonstrado que a adição de vitamina C à dieta eliminou ou reduziu a incidência da lesão em níveis tão baixos quanto aquele das aves portadoras de discondroplasia tibial induzida pela dieta, contendo 2 mg/kg 1,25-(OH)2D3. Entretanto estudos posteriores mostraram que a adição de 250, 500 ou 1.000 mg de Vitamina C/kg na ração não reduziu a incidência de discondroplasia tibial, tanto na ausência como na presença de vitamina D (Edwards, 2000), sugerindo que a vitamina C não previne a discondroplasia tibial em aves (Leach & Burdette, 1985; Edwards, 1989).

Cloreto de sódio

Dentre os minerais das dietas para aves, o cloreto de sódio é, provavelmente, o macromineral essencial mais barato de todos os nutrientes. O íon sódio é o cátion mais abundante do fluido extracelular (ECF), e o cloreto o principal ânion, cuja concentração média no ECF é da ordem de 140 e 105 mmol.L-1, respectivamente (Harper et al.,1997; Underwood & Suttle, 1999). A osmolaridade, a concentração de sódio e o volume de líquido extracelular dependem de fatores dietéticos, ambientais (calor, frio, pressão atmosférica) e do sistema hormonal renina-angiotensina-aldosterona (Detweiler, 1996; Harper et al., 1997; Underwood & Suttle, 1999). Quando o consumo de sódio é alto, a produção de aldosterona cai e a excreção de sódio, pela urina, aumenta. Por outro lado, quando o consumo de sódio é baixo, o rim produz mais aldosterona e a eliminação de sódio na urina diminui. Além disso, tem sido demonstrado que o desequilíbrio osmótico, causado por deficiências dietéticas ou excessos de sódio, potássio e cloreto é regulado pelo complexo sistema vasopressina e renina-angiotensina-aldosterona (Detweiler, 1996; Harper et al., 1997; Underwood & Suttle, 1999). Esse sistema é importante para o processo de regulação da osmolalidade, manutenção da pressão osmótica dos líquidos corporais, protegendo o organismo contra a perda excessiva de líquido.

O sódio também participa do controle da passagem de nutrientes para as células (Maynard et al., 1984), da regulação do volume celular, da absorção de pirimidinas, de aminoácidos, de carboidratos e de sais biliares (Harper et al., 1997). Além disso, ele também participa da condução de impulsos nervosos, do controle da contração muscular e da manutenção dos potenciais de membrana.

Embora os íons sódio e cloreto sejam considerados essenciais para o ótimo crescimento e desenvolvimento do esqueleto, bem como para prevenir e diminuir a incidência da discondroplasia tibial em aves, resultados contraditórios têm sido publicados em relação às necessidades diárias desses íons. Nesse sentido, o NRC (1994) recomenda a adição de 0,2% dos íons cloreto e sódio à dieta no período de 0 a 3 semanas de idade, nível esse superior àquele recomendado pelo mesmo NRC em 1984. Valores semelhantes também foram recomendados por Britton (1991) e por Zanardo (1994). Por outro lado, Murakami et al. (1997) verificaram que os melhores resultados foram obtidos com níveis dietéticos de 0,25% de sódio. Além disso, estudos de Butolo et al. (1995) sobre a influência dos níveis de NaCl na conversão alimentar de frangos de corte indicam uma exigência de 0,55% de NaCl ou 0,22% de sódio.

Segundo Oviedo-Rondón et al. (2001), a exigência de íons sódio e de cloreto para o máximo desempenho de frangos de corte é de 0,28% e 0,25%, respectivamente. Esses autores verificaram, ainda, que a área da zona hipertrófica da metáfise proximal do tibiotarso diminuiu com o aumento dos níveis do íon sódio, diminuindo assim a probabilidade de incidência de discondroplasia tibial.

Murakami et al. (2001), estudando as exigências nutricionais dos íons sódio e cloreto para frangos de corte, observaram que a área da zona hipertrófia aumentou com o aumento da concentração do íon cloreto, sugerindo que altos níveis de cloreto podem aumentar a probabilidade de incidência de discondroplasia tibial. Além disso, segundo esses autores, as exigências desses íons para o máximo crescimento dos frangos de corte, no período compreendido entre 21 a 42 dias de idade, é de 0,15% para o íon sódio e de 0,23% para o íon cloreto, respectivamente.

Perspectivas

Parece evidente que as aves portadoras de altos índices de discondroplasia tibial têm um defeito no metabolismo da vitamina D, sugerindo que o estímulo mecânico juntamente com o genótipo e alterações nos constituintes da dieta podem interromper os eventos envolvidos no processo de diferenciação dos condrócitos e desencadear o processo de formação da lesão. O principal desafio para o futuro é estabelecer se o aporte externo de vitamina D3 é suficiente para prevenir a discondroplasia tibial e/ou se discondroplasia tibial é devida à mecanismos e/ou defeito(s) mais complexo(s).

Os minerais constituem uma pequena porção das dietas de aves, mas são essenciais para prevenir as deficiências e, conseqüentemente, patologias. Alguns minerais, particularmente o cloreto de sódio, exercem funções essenciais no organismo animal, e o uso de concentrações apropriadas desse mineral na dieta de aves é muito importante para a regulação dos processos fisiológicos, bem como prevenir o desenvolvimento da discondroplasia tibial em aves.

A descoberta de novas técnicas de biologia molecular, de novos fatores e de novas moléculas envolvidas na biomineralização podem fornecer dados que possam, ulteriormente, ser utilizados em estudos moleculares e estabelecer estratégias de ajuda para o tratamento de doenças do tecido ósseo. A compreensão do mecanismo de ação dessas biomoléculas pode levar à descoberta de uma condição ideal na prevenção da discondroplasia tibial em alguns animais, mas não em outros.

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  • Endereço para correspondência
    João Martins Pizauro Júnior
    Depto. de Tecnologia, FCAV / UNESP
    Via de Acesso Profº Paulo Donato Castelanne, Km 5
    14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil
    E-mail:
  • 1
    Depto. de Tecnologia, FCAV/UNESP, Jaboticabal
    2
    Depto. de Química, FFCLRP/USP, Ribeirão Preto
    3
    Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      19 Maio 2003
    • Data do Fascículo
      Dez 2002
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