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Efeito antibacteriano e antiaderente in vitro do extrato da Punica granatum Linn. sobre microrganismos do biofilme dental

In vitro antibacterial and antiadherence effect of the extract of the Punica granatum Linn. upon dental biofilm microrganisms

Resumos

Nesta pesquisa foi avaliada a atividade antimicrobiana e a capacidade de inibição da síntese de glucano in vitro do extrato da casca do fruto da romã (Punica granatum Linn.) sobre linhagens bacterianas de Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. Os ensaios foram realizados pelas técnicas de ágar-difusão em placas para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e técnica dos tubos inclinados para determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) ao vidro, na presença de 5% de sacarose. Os mesmos procedimentos foram realizados com a clorexidina à 0,12%. As CIMs (mg/mL) do extrato da P. granatum frente ao S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e L. casei foram 1:32, 1:8, 1:8, 1:512, e 1:128, respectivamente. Para as CIMAs o extrato da P. granatum mostrou resultados melhores que a clorexidina, exceto para o S. mutans com achados semelhantes na diluição de 1:256. Os resultados mostram a potencialidade da P. granatum na inibição do crescimento bacteriano e síntese de glucano representada pela aderência ao vidro, sugerindo o emprego do extrato da romã, como meio alternativo, no controle desses microrganismos na formação do biofilme.

Punica granatum; atividade antimicrobiana; efeito antiaderente; biofilme dental; Streptococcus


In this study was evaluated the in vitro antibacterial activity and the inhibition of glucan sintesis of the fruit bark of Punica granatum Linn extract upon the following dental biofilm bacteria: Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus and Lactobacillus casei. The tests were carried out by inundation tecniques in Petri dishes to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and inclined tubes techniques to determine the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence to glass (MICA) at the presence of 5% sucrose. Tests with gluconate of chlorexidine (0.12%) were performed as controls. MICs of the P granatum extract dilutions (mg/mL) against S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e L. casei were 1:32, 1:8, 1:8, 1:512, and 1:128 respectively. For MICAs the P. granatum showed better results than chlorexidine, except for S. mutans with both substances showing similar results of 1:256. It can be concluded that the extract of the P. granatum has the potential to inhibit oral bacterial growth and glucan sintesis. The extract of the Punica granatum might be used as an effective antibacterial alternative agent against oral biofilm bacteria.

Punica granatum; antibacterial activity; effect antiaderent; dental biofilme; Streptococcus


ARTIGO

Efeito antibacteriano e antiaderente in vitro do extrato da Punica granatum Linn. sobre microrganismos do biofilme dental

In vitro antibacterial and antiadherence effect of the extract of the Punica granatum Linn. upon dental biofilm microrganisms

Jozinete V. PereiraI, * * E-mail: jozinete.vieira@bol.com.br, Tel. +55-83-32355091 ; Maria S. Vieira PereiraII; Fábio C. SampaioIII; Maria C. Correia SampaioIII; Pollianna M. AlvesIII; Cristina R. Ferreira de AraújoIII; Jane S. HiginoIV

IDepartamento de Odontologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual da Paraíba, Rua Juvêncio Arruda s/n, Campus Universitário de Bodocongó, 58.100-000, Campina Grande, PB, Brasil

IIDepartamento de Biologia Molecular, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba, 58.059-900, João Pessoa, PB, Brasil

IIIDepartamento de Odontologia Clínica Social, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, 58.051-900, João Pessoa, PB, Brasil

IVDepartamento de Farmácia, Centro de Ciências e da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Arthur de Sá s/n, 50.740-521, Recife, PE, Brasil

RESUMO

Nesta pesquisa foi avaliada a atividade antimicrobiana e a capacidade de inibição da síntese de glucano in vitro do extrato da casca do fruto da romã (Punica granatum Linn.) sobre linhagens bacterianas de Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. Os ensaios foram realizados pelas técnicas de ágar-difusão em placas para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e técnica dos tubos inclinados para determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) ao vidro, na presença de 5% de sacarose. Os mesmos procedimentos foram realizados com a clorexidina à 0,12%. As CIMs (mg/mL) do extrato da P. granatum frente ao S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e L. casei foram 1:32, 1:8, 1:8, 1:512, e 1:128, respectivamente. Para as CIMAs o extrato da P. granatum mostrou resultados melhores que a clorexidina, exceto para o S. mutans com achados semelhantes na diluição de 1:256. Os resultados mostram a potencialidade da P. granatum na inibição do crescimento bacteriano e síntese de glucano representada pela aderência ao vidro, sugerindo o emprego do extrato da romã, como meio alternativo, no controle desses microrganismos na formação do biofilme.

Unitermos:Punica granatum, atividade antimicrobiana, efeito antiaderente, biofilme dental, Streptococcus.

ABSTRACT

In this study was evaluated the in vitro antibacterial activity and the inhibition of glucan sintesis of the fruit bark of Punica granatum Linn extract upon the following dental biofilm bacteria: Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus and Lactobacillus casei. The tests were carried out by inundation tecniques in Petri dishes to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and inclined tubes techniques to determine the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence to glass (MICA) at the presence of 5% sucrose. Tests with gluconate of chlorexidine (0.12%) were performed as controls. MICs of the P granatum extract dilutions (mg/mL) against S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e L. casei were 1:32, 1:8, 1:8, 1:512, and 1:128 respectively. For MICAs the P. granatum showed better results than chlorexidine, except for S. mutans with both substances showing similar results of 1:256. It can be concluded that the extract of the P. granatum has the potential to inhibit oral bacterial growth and glucan sintesis. The extract of the Punica granatum might be used as an effective antibacterial alternative agent against oral biofilm bacteria.

Keywords:Punica granatum, antibacterial activity, effect antiaderent, dental biofilme, Streptococcus.

INTRODUÇÃO

As mais prevalentes desordens dentais estão relacionadas com a cárie e doença periodontal, onde os microrganismos presentes no biofilme dental atuam como principais agentes responsáveis (Löe, 1978; Loesche, 1986; Pereira, 1999). A placa bacteriana tem sido definida como um biofilme de microrganismos, contidos em matriz orgânica formada por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro e por polímeros bacterianos (Gebara; Zardetto; Mayer, 1996; Marsh, 1992).

A formação do biofilme ocorre através de um processo ordenado e dinâmico onde há necessidade da fixação e proliferação de bactérias sobre as superfícies dos dentes (Addy; Slayne; Wade,1992); a aderência bacteriana à película adquirida representa um dos primeiros mecanismos envolvidos na iniciação do desenvolvimento do biofilme dental (Almeida, 2002; Gibbons, 1984; Liljemark; Schver; Bloomquist, 1978).

Devido a sua conduta contínua de agressão, o biofilme dental em cada etapa do seu desenvolvimento vai adquirindo novas espécies, dentre estas Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei; que com sua patogenicidade irão provocar danos ao esmalte e tecido gengival (De Micheli; Sarian, 1990; Feist; De Micheli; Sarian , 1989; Kornman, 1986; Peres,2003).

A remoção mecânica do biofilme é um fator importante na prevenção da cárie e doença periodontal. No entanto, existem dificuldades na remoção feita pelo próprio paciente (Addy; Slayne; Wade, 1992; De Paola, 1989; Stefani; Lima, 1996). Por se tratar de uma associação organizada, proliferante, enzimaticamente ativa, capaz de se aderir à superfície dos dentes, ocasionando alterações patológicas na cavidade bucal, é indicada sua desorganização tão logo quanto possível (Ciancio, 1992). Considerando a importância dessa desorganização e as dificuldades de manter os indivíduos motivados para realizar uma adequada limpeza da cavidade bucal, com o objetivo primário em termos de saúde bucal, que é controlar o acúmulo das bactérias sobre às estruturas dentárias, é válido e necessário associar aos procedimentos mecânicos também métodos químicos para o controle do biofilme dental (Castro, 2001; Cury, 1997; Mendes; Zenóbio; Pereira, 1995).

Inúmeras substâncias químicas vêm sendo pesquisadas, com o objetivo de inibir a formação do biofilme dental, crescimento bacteriano, e consequentemente a adesão de microrganismos à superfície dentária (Kornman, 1986, Rodrigues Júnior, 1998). Dentre estas substâncias, atualmente se destacam os produtos de origem vegetal por se mostrarem potencialmente eficazes no que se refere à sua atividade antimicrobiana sobre várias espécies de microrganismos (Bhakuni et al., 1974; Gebara; Zardetto; Mayer, 1996).

Estudos sobre a ação anticariogênica de polifenóis extraídos de plantas têm sido relatados nas últimas décadas (Kakiuchi et al. 1996). Os extratos da romã, cajueiro, sanguinarina, tomilho e malva têm demonstrado ação antibacteriana e antiaderente in vitro, sobre os microrganismos Gram-positivos e Gram- negativos (Palenik et al. 1979; Naqvi; Khan; Vohora, 1991; Pessini et al., 2003; Michelin et al., 2005); os Streptococcus mutans, S. mitis, S. sanguis têm apresentado grande sensibilidade ao extrato da romã (Punica granatum) no que se refere ao crescimento e à capacidade de aderência sobre a superfície dental (Pereira, 1998).

A romanzeira, Punica granatum é uma planta da família Punicaceae, cultivada mundialmente em regiões de clima tropical e subtropical. Garcia(1992) afirmou que essa planta apresenta propriedades antiinflamatória e antibacteriana. Naqvi; Khan; Vohora, (1991) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato de Punica granatum sobre microrganismos Gram-positivos e leveduras, confirmando a presença de princípios ativos antimicrobianos na casca do fruto.

Assim sendo, o propósito deste estudo foi verificar in vitro a ação antibacteriana do extrato da Punica granatum, e analisar a capacidade de inibição da síntese de glucano frente as linhagens bacterianas de Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e Lactobacillus casei presentes no biofilme supragengival.

MATERIAL E MÉTODOS

Material botânicoe obtenção da matéria prima

A matéria prima (fruto) da Punica granatum foi obtida de origem diversa, no mercado público central de João Pessoa - PB e identificado botanicamente no Laboratório de Toxicologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE (Universidade Federal de Pernambuco - Recife). Os frutos foram lavados com água e posteriormente separados em casca e mesocarpo, sendo a casca o material a ser utilizado na pesquisa. Em seguida a casca foi levada à secagem, em estufa a 33ºC durante uma semana, para eliminação de umidade e estabilização do conteúdo enzimático. Passado este período o material foi retirado da estufa, triturado a pó em moinho elétrico e então submetido ao processo de extração dos princípios ativos.

Extração

O método de extração empregado foi a lixiviação ou percolação em fluxo contínuo à temperatura ambiente. Por se tratar de uma matéria rica em polifénois de fácil modificação estrutural, não foi utilizada a extração à quente, preservando assim a estabilidade do material. Na lixiviação em fluxo contínuo utilizou-se um processo onde existe a renovação constante da solução extratora (solução hidroalcoólica a 80% v/v) durante um período de 24 horas. Decorrido este tempo o marco fica completamente esgotado. Nesta etapa, foram utilizados aproximadamente 8 litros de solução hidroalcoólica para 1 Kg de matéria prima seca e pulverizada, visando o completo esgotamento da droga. Recuperou-se um volume de aproximadamente 6.600 mL do extrato que, após filtração para retirada de resíduos sólidos, foram acondicionados em frascos âmbar, limpos, secos e estocados em câmara fria.

Concentração do extrato

A etapa seguinte foi a concentração da solução em nível de extrato fluido 1:1 (p/v). O procedimento para a concentração do extrato foi realizado em evaporador rotatório (Modelo Ika-Werk), a uma temperatura constante de 45ºC. O extrato obtido apresentou um pH ligeiramente ácido, em torno de 4,74.

Os procedimentos de extração e concentração dos extratos hidroalcoólicos foram realizados no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).

Linhagens bacterianas

Utilizou-se no presente trabalho linhagens bacterianas padronizadas de Streptococcus mitis (ATCC 9811), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sanguis (ATCC 10557), Streptococcus sobrinus (ATCC 27609) e Lactobacillus casei (ATCC 7469), obtidos mediante solicitação na Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia “André Tozello” (Campinas - SP) e Instituto Adolfo Lutz - SP, respectivamente.

Determinação da atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de Punica granatum

A atividade antimicrobiana em placas foi determinada pelo método de difusão em meio sólido para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato de Punica granatum, sobre as linhagens bacterianas. As linhagens foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI - Brain Hear Infusion - DIFCO). Foram realizadas perfurações no meio de cultura (Agar Müeller Hinton - DIFCO) de aproximadamente 6mm de diâmetro. Nos orifícios foram colocados um volume de 50µl da solução do extrato diluída, variando da diluição 1:1 a 1:1024. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC em microaerofilia, por um período de 24 horas. Foram realizados estudos comparativos com a clorexidina a 0,12%; os ensaios foram feitos em duplicata frente a cada linhagem ensaiada. A CIM foi considerada como a menor concentração do extrato que inibiu completamente o crescimento bacteriano, ou seja, presença do halo de inibição.

Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)

A concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) da bactéria ao vidro foi determinada na presença de sacarose a 5%, usando-se concentrações crescentes e dobradas da solução diluída do extrato, variando de 1:1 a 1:1024. A partir do crescimento “overnight”, as linhagens foram sub-cultivadas a 37ºC em caldo Müeller-Hinton (DIFCO), em microaerofilia, por um período de 24 horas obtendo-se um inóculo de 106 UFC/ml. A incubação foi feita a 37ºC por 24 horas em microaerofilia, com os tubos inclinados a 30º. A CIMA foi definida como a menor concentração do extrato em meio com sacarose que impediu a aderência bacteriana ao tubo de vidro.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Vários agentes antimicrobianos vêm sendo estudados, com o objetivo de inibir ou reduzir a formação do biofilme dental, crescimento bacteriano, e consequentemente a adesão de microrganismos à superfície dentária (Kornman, 1986; Moranet al.,2001; Rodrigues Júnior et al., 1998).

Nas últimas décadas, os fitofármacos têm assumido um papel importante como meio terapêutico alternativo na odontologia, mediante as suas propriedades antimicrobianas frente às afecções bucais, principalmente as decorrentes do biofilme dental (Bhakuni, et al., 1974; Gebara; Zardetto; Mayer, 1996; Pereira, 1998). Akpata e Akinrimisi (1977) afirmam que o extrato aquoso de plantas inibe o crescimento de Streptococcus mutans no biofilme dental, patógeno altamente responsável pela formação de cárie.

Kakiuchi et al. (1986), Cáceres (1987), Naqvi et al. (1991), Anesini e Perez (1993), afirmaram que a Punica granatum possui ação antimicrobiana específica sobre bactérias presentes no biofilme supragengival, produzindo uma interferência na síntese de poliglicanos, agindo, então, no mecanismo de aderência das bactérias sobre as superfícies dos dentes. Como a aderência bacteriana tem sido mostrada como sendo um dos primeiros mecanismos envolvidos na iniciação do desenvolvimento do biofilme dental, a inibição desse processo, certamente, conduzirá a um efetivo controle qualitativo do mesmo.

No presente estudo, buscou-se verificar a ação do extrato hidroalcoólico de Punica granatum sobre espécies de microrganismos aeróbios predominantes no biofilme supragengival; Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e Lactobacillus casei. Os resultados demonstram a eficácia do extrato da romã sobre as linhagens ensaiadas. Todas as linhagens são sensíveis ao extrato hidroalcoólico de Punica granatum. Observou-se halos de inibição que variaram de 10 a 25 mm, sendo considerado ativo o extrato que mostrou halos de inibição superior a 15 mm. A inibição do crescimento apresentou-se homogênea, de acordo com o grau de concentração do extrato hidroalcoólico da planta em estudo. Houve uma diminuição proporcional do diâmetro dos halos, a medida que concentração do extrato foi diminuída, conforme apresentado na Tabela 1.

Com relação à clorexidina observamos resultados semelhantes com uma proporcionalidade entre diminuição do diâmetro dos halos de inibição e a diminuição da concentração da substância (Tabela 2).

A clorexidina tem sido muito utilizada no controle de formação do biofilme dental, age alterando a composição bacteriana do biofilme supragengival produzindo uma redução significante sobre o número de Streptococcus mutans por períodos prolongados. Segundo Beighton; Decker; Homer (1991) este fato ocorre devido à sua liberação lenta na cavidade bucal, e consequentemente a sua ação inibidora sobre as enzimas glicosídicas e proteolíticas.

O biofilme dental é essencial na patogênese da cárie dental e constitui o maior fator etiológico na gengivite crônica (Addy; Slayne; Wade, 1992). A presença de polissacarídeos extracelulares é de extrema importância na fase inicial do processo de formação do biofilme, pois os mesmos favorecem ao mecanismo de aderência intermicrobiana de Streptococcus mutans e S. sobrinus (Ikeno; Ikeno; Miyazawa, 1991; Siegristet al.,1986).

A adesão das bactérias às superfícies orais constitui um processo complexo multifatorial, influenciado pelo ambiente, superfície da célula bacteriana e a superfície do substrato.

O mecanismo de aderência das bactérias sobre as superfícies dos dentes envolve adesinas presentes na membrana da célula bacteriana e receptores específicos localizados na película adquirida. Vários fatores estão associados a esse mecanismo, dentre estes, a interação de proteínas, adesinas, lecitinas e interações hidrofóbicas representam um papel importante nesse processo (Gibbons, 1984). Desta forma, a interferência com a adesão bacteriana nas superfícies dos dentes pode ser um caminho para se obter o controle da placa, e consequentemente previnir a instalação de patologias bucais.

Poucos estudos relatam a influência dos agentes antimicrobianos nos estágios iniciais de formação do biofilme, especialmente com relação a seu efeito sobre os fatores envolvidos na aderência bacteriana à película adquirida (Cai et al., 1994, Van Loveren; Buijs; Ten Cate, 2000).

Neste estudo o extrato de Punica granatum foi efetivo na inibição da aderência das cinco linhagens representada pela ausência de aderência ao vidro na presença de sacarose (Tabela 3). Estes resultados são concordantes com os observados por Kakiuchi et al. (1986), que realizaram um estudo relacionado à atividade antimicrobiana de plantas, tais como Galla rhois e Punica granatum. Estas plantas produzem um efeito inibitório que interfere na síntese do glucano pela glucosiltransferase, produzido pelo Streptococcus mutans que, consequentemente, irá intervir no mecanismo de aderência deste microrganismo sobre as superfícies dos dentes.

O estudo comparativo da ação do extrato da Punica granatum com o gluconato de clorexidina, revelou uma maior atividade de inibição de síntese de glucano pelo extrato da romã (Tabela 3). Os resultados são bastante promissores uma vez que os microrganismos neste estudo são os maiores responsáveis pela formação do biofilme dental.

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste estudo mostram a importância das indicações terapêuticas das plantas medicinais como método alternativo e de baixo custo na clínica odontológica, uma vez que o extrato hidroalcoólico da casca do fruto da romã apresenta potencial atividade antimicrobiana sobre os microrganismos presentes no biofilme supragengival, como também demonstra, in vitro, inibição da aderência bacteriana na superfície, fator predisponente para o desenvolvimento da cárie e doenças periodontais.

Recebido em 30/04/05

Aceito em 17/01/06

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  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      26 Fev 2008
    • Data do Fascículo
      Mar 2006

    Histórico

    • Recebido
      30 Abr 2005
    • Aceito
      17 Jan 2006
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