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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.69 no.6 Belo Horizonte Nov./Dec. 2017

https://doi.org/10.1590/1678-4162-8982 

Medicina Veterinária

Imunidade celular em vacas Holandesas soropositivas para o Vírus da Leucose Bovina (BLV) durante o período de transição

Cellular immunity in Holstein cows seropositive for Bovine Leukosis Virus (BLV) during the transition period

V. Gomes1 

V.A.P. Baldacim1 

J.F.R. Costa1 

C.P. Costa e Silva1 

J.R.P. Arcaro2 

M.S. Miranda2 

R.S. Sousa1 

J.J. Fagliari3 

K.M. Madureira4 

1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia ˗ Universidade de São Paulo ˗ São Paulo, SP

2Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (Apta) ˗ São Paulo, SP

3Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias ˗ Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” ˗ Jaboticabal, SP

4Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia ˗ Universidade Federal da Bahia ˗ Salvador, BA


RESUMO

Esta pesquisa avaliou a dinâmica dos leucócitos e das subpopulações de linfócitos em vacas Holandesas soropositivas para o BLV no período de transição. Amostras de sangue (n=72) provenientes de 12 vacas foram coletadas entre as semanas -2 e +3 para a realização do leucograma, imunofenotipagem, dosagem de cortisol e haptoglobina (Hp). O perfil leucocitário foi caracterizado por leucocitose, neutrofilia, monocitose e eosinopenia próximo ao parto. Linfocitose e elevada proporção de linfócitos B CD21+ foram achados constantes entre as semanas -2 e +3; assim, as vacas foram testadas e confirmadas soropositivas para o BLV. Os valores das subpopulações de linfócitos T apresentaram-se baixos durante o período de transição, observando-se dois picos máximos que coincidiram com as elevações nas concentrações de cortisol no parto (2,11µg/dL) e semana +3 (1,97µg/dL). Hp apresentou aumento crescente de -2 (166µg/mL) a +3 (576µg/mL), provavelmente associada à elevada taxa de infecções uterinas observadas nas semanas +2 e +3. As vacas soropositivas para o BLV apresentaram leucograma de estresse próximo ao parto, exceto para linfócitos. A linfocitose e as elevadas proporções de células B CD21+, associadas com as baixas proporções de células T, podem ser indicativo de imunossupressão e predisposição aos processos inflamatórios no período pós-parto.

Palavras-chave: periparto; haptoglobina; cortisol; subpopulações de linfócitos

ABSTRACT

This research evaluated the dynamics of leukocytes and lymphocytes subsets in seropositive Holstein cows for BLV during the transition period. Blood samples (n=72) from 12 cows were harvested from week -2 up to week +3 to perform leukogram, immunophenotyping, cortisol and haptoglobin (Hp). Leukocytes pattern was characterized by leukocytosis, neutrophilia, monocytosis and eosinopenia around calving. Lymphocytosis and high proportions of B cells CD21+ were a constant finding between week -2 and +3, thus cows were tested and confirmed seropositive for BLV. The values of T lymphocytes subsets were low during the transition period, observing two peaks that coincided with high levels of cortisol at delivery (2.11µg/dL) and week +3 (1.97µg/dL). Hp had gradual increase from week -2 (166µg/mL) until week +3 (576g/mL) probably due to high rate of uterine infection detected between week +2 and +3. The seropositive cows for BLV presented stress leukogram around delivery, except for lymphocytes. Lymphocytosis and the high proportions of B cells, associated with the low proportions of T lymphocytes, can be indicative of immunosuppression and predisposition to the inflammatory process observed in the post-partum period.

Keywords: peripartum; haptoglobin; cortisol; lymphocytes subsets

INTRODUÇÃO

O crescimento da indústria leiteira nas últimas décadas exigiu a seleção genética por produção, o que resultou em aumento dos requerimentos energéticos. Esse fenômeno é intensificado no período de transição devido à nutrição fetal, colostrogênese e lactogênese (Ingvartsen e Moyes, 2013). O atendimento às demandas energéticas impostas no período de transição é dependente de mecanismos homeostáticos e homeorréticos, regulados pela secreção das catecolaminas, pelo cortisol, pela insulina, pelo glucagon, pelo hormônio do crescimento e pelo hormônio semelhante à insulina do tipo I (Drackley, 1999).

A adaptação metabólica das vacas ocorre em concomitância com uma série de fatores estressantes, incluindo mudanças na dieta, reagrupamentos sociais e alterações físicas, hormonais e fisiológicas associadas ao parto. Esses eventos resultam na liberação do cortisol e em situação de alerta orgânico, no qual as células de defesa são redistribuídas, observando-se o influxo dos neutrófilos e efluxo dos linfócitos dos tecidos para os vasos sanguíneos (Davis et al., 2008). Os glicocorticoides também alteram a transcrição gênica da interleucina 12, que estimula a resposta proliferativa dos linfócitos mediante estímulo antigênico. Esse mecanismo está associado com a diminuição da proporção de linfócitos auxiliares (CD4+) e citotóxicos (CD8+), observados ao redor da parição (Van Kampen e Mallard, 1997; Kimura et al., 2002).

Linfócitos B (CD21+) apresentam padrão variável durante o periparto. Foram relatados valores constantes e similares ao período de lactação plena (Van Kampen e Mallard, 1997; Kimura et al., 2002), enquanto outros autores observaram decréscimo na população de células B (Ohtsuka et al., 2010) ou acréscimo (Meglia et al., 2005).

O balanço e a interação entre as diferentes células do sistema imune, especialmente as subpopulações de linfócitos, são fundamentais para a defesa do organismo contra os agentes infecciosos. Alterações nas proporções e migração das subpopulações de linfócitos podem afetar a resposta imune local e a sistêmica (Van Kampen e Mallard, 1997), tornando os animais susceptíveis aos processos inflamatórios pós-parto devido à mastite e à metrite.

O desequilíbrio entre as subpopulações de linfócitos sanguíneos em vacas Holandesas, independentemente do ciclo de lactação, pode ser afetado pelo vírus da leucose bovina (BLV). Esse vírus infecta células B e compromete a homeostase das subpopulações de linfócitos pelo desequilíbrio entre a proliferação e a morte celular (Souza et al., 2011). A soroprevalência para o BLV em rebanhos leiteiros, na região Sudeste do Brasil, é de aproximadamente 49,53 - 79,75% (Rajão et al., 2014). Apesar da elevada ocorrência, ainda não existem descrições sobre o perfil dos leucócitos sanguíneos em vacas soropositivas para o BLV no período de transição.

A dinâmica e a atividade funcional das células imunes no período de transição possuem destaque na literatura internacional, entretanto pesquisas nacionais que consideram as condições sanitárias de criação brasileiras são escassas e incluem um curto período de avaliação. Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a resposta imune celular em vacas Holandesas soropositivas para o BLV durante o período de transição.

MATERIAL E MÉTODOS

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (Protocolo #2767/2012).

Este estudo foi conduzido entre setembro e novembro de 2013, em fazenda experimental pertencente à Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (Apta), localizada na cidade de Nova Odessa - São Paulo (latitude 2275’S e longitude 4727’W). Para tanto, foram selecionadas 12 vacas da raça Holandesa, entre a segunda e a quarta parição, de acordo com a data da inseminação e a previsão de parto.

As condições de manejo adotadas durante o experimento foram conduzidas de acordo com a rotina da fazenda. As vacas foram transferidas para piquete maternidade, composto por capim do gênero Cynodon (coast-cross e tifton), aos 30 dias do parto previsto. Em relação às condições de bem-estar das vacas, observaram-se variações de acordo com as condições climáticas do período, considerando-se a ausência de cobertura no piquete maternidade, exceto pela existência de algumas árvores. Não existiam áreas específicas para a parição e os partos não eram assistidos no período noturno.

A composição da dieta oferecida para as vacas no pré e pós-parto era igual (Tab. 1), entretanto as quantidades de silagem de milho (pré-parto: 20kg; pós-parto: 35kg) e concentrado (pré-parto: total equivalente a 3kg; pós-parto: 1kg para cada litro de leite produzido) eram diferentes. A produção de leite diária dos animais variou de 25 a 30 litros entre as semanas +1 e +3. O balanço aniônico da dieta não era considerado, devido à alegação de baixos índices de ocorrência para hipocalcemia e retenção de placenta. Drench pós-parto também não era fornecido.

Tabela 1 Composição da dieta oferecida para as vacas Holandesas no período de transição 

Ingredientes %MS
Feno de tifton 3,00
Silagem de milho 47,00
Milho moído 33,00
Farelo de soja 45% 14,00
Vitaminas 2,00
Sal mineral 1,00
Composição química
Matéria seca MS (%) 65,24
Proteína bruta - PB (%) 15,11
Extrato Etéreo - EE (%) 1,80
Extrativo não nitrogenado - ENN (%) 65,58
Matéria mineral - MM (%) 6,56
Cálcio (g/kg) 2,496
Fósforo (g/kg) 5,989

As análises relativas a esta pesquisa foram realizadas entre as semanas -2 e +3 em relação ao parto. A ocorrência das doenças nesse período foi estimada pelos registros da propriedade.

Amostras de sangue (n=72) foram coletadas semanalmente por meio da punção da artéria coccígea em tubos sem e com o anticoagulante Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (1,5mg/mL). Os tubos sem anticoagulante foram centrifugados a 800xg por 20 minutos, sendo o soro armazenamento e congelado a -80°C.

Leucócitos totais foram determinados por meio de contagem automática (ABX ABC Vet, ABX Diagnostics, Brasil). O exame diferencial dos leucócitos foi realizado por metodologia manual (Birgel, 1982). O fenótipo dos linfócitos sanguíneos foi determinado pela técnica de citometria de fluxo, de acordo com o protocolo descrito por Della Libera et al. (2012). Resumidamente, 100µL de sangue foram lisados, utilizando-se solução salina isotônica (NaCl 0,2% e NaCl 1,6%). Anticorpos (ACs) monoclonais específicos para receptores de superfície dos linfócitos bovinos foram selecionados para a marcação das células (Tab. 2). As células foram incubadas com 100µL de ACs primários previamente diluídos em Phosphate Saline Buffer (PBS), por 30 minutos, a 4°C. As células foram lavadas 3x em PBS, sendo posteriormente incubadas com 100µL de ACs secundários, por 30 minutos, a 4°C, em ambiente escuro. Por fim, as células foram lavadas 2x e suspensas em 300μL de PBS. A aquisição dos eventos foi realizada em citômetro de fluxo FACS Calibur, por meio do programa CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, EUA). Os eventos adquiridos (15.000) foram avaliados quanto à emissão das fluorescências no programa FlowJo Software (Tree Star, Ashland, EUA). Os resultados foram expressos na porcentagem de células positivas para cada fluorescência associada aos marcadores de superfície. O valor absoluto das populações de linfócitos foi calculado multiplicando-se a proporção (%) das populações determinada por citometria de fluxo pelo número de linfócitos totais (células/μL).

Tabela 2 Anticorpos (Ac) usados para a marcação dos linfócitos sanguíneos 

Ac primário1 Clone Isotipo Diluição Ac secundário2 Diluição
CD3+ células T MM1A IgG1 1:200 Pe-Cy5.5 1:400
CD4+ células T CACT83B IgM 1:400 FITC 1:400
CD8+ células T BAQ111A IgM 1:200 FITC 1:100
CD21+ células B BAQ15A IgM 1:200 FITC 1:200

1Ac monoclonal primário antibovino gerado em camundongos (VMRD, Pullman, EUA).

2Ac monoclonal secundário anticamundongo gerado em caprinos (Life Technologies, Carlsbad, EUA).

As amostras de soro foram submetidas ao teste imunoenzimático para detecção de anticorpos específicos para a glicoproteína gp 51 do BLV (De Giuseppe et al., 2004).

A haptoglobina foi determinada pela separação eletroforética do soro em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (Dodecil-Sulfato de Dódio de Poliacrilamida), de acordo com o proposto por Laemmli (1970). Após a separação das frações proteicas, o gel foi corado com azul de Coomassie a 0,2%. As concentrações das proteínas foram determinadas por densitometria computadorizada (Shimadzu CS9301, Tokyo, Japão).

A concentração de cortisol foi determinada por ensaio quimiluminescente, utilizando-se kit comercial em analisador de imunoensaios Immulite 1000® (Siemens, Brasil), de acordo com as instruções do fabricante. O kit comercial detecta concentrações de cortisol ≥1,0µg/dL.

A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa estatístico SPSS 17.0 (IBM Corporation, Armonk, Nova York). As variáveis não apresentaram distribuição normal pelo teste de Shapiro-Wilk. A análise no tempo foi realizada por meio do teste de Friedman (P≤0,05). A este último teste, quando apresentou pelo menos um tempo significativamente diferente, foram realizadas as comparações múltiplas por meio do teste de Wilcoxon com correção de Bonferroni (P≤0,0033). Tendência estatística foi considerada quando o P<0,0066. Devido ao elevado número de amostras negativas ao cortisol, optou-se pela apresentação descritiva dos dados em mediana, valores mínimos e máximos.

RESULTADOS

As doenças relatadas entre a parição (semana 0) e a semana +3 foram distocia (33,4%, 4/12), retenção de placenta (8,3%, 1/12), hipocalcemia clínica (8,3%, 1/12), cetose clínica (8,3%, 1/12) e metrite (41,7%, 5/12). Duas das quatro vacas com episódios de distocia também apresentaram cetose, e do total de animais que apresentaram metrite, três já haviam desenvolvido distúrbios prévios: duas vacas com distocia e uma com retenção de placenta. Além disso, as 12 vacas desta pesquisa (12/12, 100%) apresentaram reações positivas ao teste imunoenzimático para anticorpos específicos contra o antígeno gp51 do BLV, entretanto nenhuma das vacas apresentava a forma tumoral da doença.

Os valores absolutos e relativos dos leucócitos sanguíneos em vacas Holandesas durante o período de transição estão expressos na Tab. 3. Os leucócitos totais aumentaram gradualmente da semana -2 até a parição, observando-se queda brusca no período pós-parto. Neutrófilos e monócitos apresentaram variações similares aos leucócitos totais. Os valores absolutos de linfócitos aumentaram progressivamente entre as semanas -2 e +1, seguidos por diminuição gradual nas semanas +2 e +3. Os eosinófilos diminuíram gradualmente do pré-parto até a semana +1, observando-se ligeiro aumento nas semanas +2 e +3. Basófilos foram detectados apenas nas semanas +1 e +2.

Tabela 3 Números relativo (%) e absoluto (x103 céls./µL) dos tipos leucocitários sanguíneos em vacas Holandesas no período de transição 

Células Variáveis -2 -1 Parto +1 +2 +3 Sig*
Leucócitos (x103 céls./µL) Mediana 11,6 13,0 21,9 11,9 10,7 12,1 0,006
Mínimo 6,1 7,8 10,2 5,3 7,0 7,6
Máximo 30,8 37,1 54,4 27,1 37,6 35,0
Neutrófilos (x103 céls./µL) Mediana 3,95 4,78 7,80 2,46 2,59 3,35 0,003
Mínimo 1,33 1,87 0 0,22 0,44 0,38
Máximo 5,93 7,17 31,55 9,15 16,86 5,60
Neutrófilos (%) Mediana 34,5 28,0 37,5 21,5 25,5 28,5 0,015
Mínimo 11 13 18 2 6 4
Máximo 48 56 67 69 77 40
Eosinófilos (x103 céls./µL) Mediana Mínimo Máximo 0,92 0,99 0,31 0,22 0,33 0,52 0,038
0 0,36 0 0 0 0,09
1,99 2,04 1,32 1,41 1,54 3,06
Eosinófilos (%) Mediana 5,5 6,5 1,0 2,0 2,0 3,5 0,010
Mínimo 0 3 0 0 0 0,1
Máximo 19 10 9 22 18 21
Basófilos (x103 céls./µL) Mediana 0 0 0 0,10 0,07 0,04 0,756
Mínimo 0 0 0 0 0 0
Máximo 0,13 0,24 0,44 0,13 0,37 0,17
Basófilos (%) Mediana 0 0 0 1,0 0,5 0 0,718
Mínimo 0 0 0 0 0 0
Máximo 1 2 2 2 1 2
Monócitos (x103 céls./µL) Mediana 0,18 0,38 0,44 0,03 0,00 0,04 0,000
Mínimo 0 0 0 0 0 0
Máximo 0,896 1,855 2,176 0,762 0,219 0,484
Monócitos (%) Mediana 1,0 3,0 2,0 0,5 0 0 0,004
Mínimo 0 0 1 0 0 0
Máximo 7 6 4 6 3 4
Linfócitos (x103 céls./µL) Mediana 6,64 7,15 7,85 8,02 6,47 6,78 0,587
Mínimo 3,05 4,10 0 2,65 4,76 5,17
Máximo 22,88 27,10 26,71 32,30 24,66 27,55
Linfócitos (%) Mediana 53,5 60,0 56,5 75,0 67,0 63,0 0,021
Mínimo 42 32 28 29 23 44
Máximo 88 78 77 94 91 88

*Diferenças estatísticas pelo teste de Friedman (P≤0,05).

Todos os componentes do leucograma apresentaram variações durante o período de transição, segundo o teste de Friedman (P≤0,05), com exceção do número absoluto de linfócitos (P=0,587) e basófilos (P=0,756). A comparação múltipla pelo teste de Wilcoxon com correção de Bonferroni identificou apenas tendências estatísticas entre o dia da parição e a semana -2 (P=0,006) e entre as semanas -1 (P=0,006) e +3 (P=0,006) para os leucócitos totais; entre as semanas 0 e -1 (P=0,005) para os valores relativos de eosinófilos; entre as semanas +1 e -2 para os valores absolutos de eosinófilos (P=0,004); e entre as semanas 0 e +2 para os valores absolutos (P=0,004) de monócitos.

Os valores medianos absolutos e relativos das populações de linfócitos estão apresentadas na Tab. 4. Os valores medianos para os linfócitos (CD3+) aumentaram da semana -2 ao parto, observando-se diminuição nos momentos subsequentes. Apesar das variações observadas, não foi possível detectar diferenças no tempo para CD3+ (P≥0,05). Os valores relativos (%) e absolutos (x103cells/µL) para o linfócito T auxiliar (CD3+CD4+) diminuíram entre as semanas -2 e -1, observando-se picos máximos ao redor da parição e nas semanas +2 e +3. Foi possível detectar variações no tempo para as proporções de CD3+CD4+ (P=0,029), entretanto a comparação múltipla entre os tempos apresentou P≥0,003. Os valores absolutos de T citotóxicos (CD3+CD8+) aumentaram progressivamente do período pré-parto ao parto, observando-se diminuição dos valores no período pós-parto. Os valores relativos para T citotóxico também aumentaram da semana -2 ao parto, em seguida, as proporções celulares diminuíram na semana +1, observando-se pico máximo nas semanas +2 e +3. Foi possível identificar variações no tempo para as proporções de CD3+CD8+ (P=0,016), entretanto a comparação múltipla entre os tempos apresentou P≥0,003.

Tabela 4 Valores relativos (%) e absolutos (x103 céls./µL) das populações de linfócitos, determinados por citometria de fluxo, em amostras de sangue provenientes de 12 vacas Holandesas no período de transição 

Populações Variáveis -2 -1 Parto +1 +2 +3 Sig*
CD3+ (x103 céls./µL) Mediana 2,67 2,83 4,06 3,02 2,97 3,05 0,787
Mínimo 1,90 1,94 2,12 0,23 0,36 1,07
Máximo 6,87 7,14 11,21 6,16 5,29 7,08
CD3+ (%) Mediana 36,7 37,5 43,4 38,5 33,1 39,2 0,889
Mínimo 20,5 20,0 19,9 3,6 5,6 18,0
Máximo 61,5 61,0 55,8 60,1 56,8 57,9
CD3+CD4+ (x103 céls./µL) Mediana 0,60 0,40 0,97 0,60 0,83 0,95 0,203
Mínimo 0,18 0,38 0,29 0,10 0,27 0,34
Máximo 1,12 1,42 2,27 1,05 1,55 1,72
CD3+CD4+ (%) Mediana 7,0 4,4 9,0 5,6 10,2 11,0 0,029
Mínimo 1,2 0,5 3,4 3,2 3,8 5,6
Máximo 16,1 17,0 16,4 17,4 20,3 24,3
CD3+CD8+ (x103 céls./µL) Mediana 0,68 0,71 1,08 0,73 0,77 0,79 0,335
Mínimo 0,30 0,36 0,21 0,17 0,41 0,44
Máximo 1,69 1,90 4,77 1,80 3,02 1,89
CD3+CD8+ (%) Mediana 7,2 9,0 9,3 8,4 10,6 8,4 0,016
Mínimo 4,6 6,2 4,7 4,8 7,6 4,8
Máximo 16,8 17,4 23,7 23,3 18,1 26,0
CD21+ (x103 céls./µL) Mediana 3,54 3,33 3,85 2,92 3,79 3.49 0,098
Mínimo 0,91 1,20 1,41 0,78 0,73 2,14
Máximo 2,36 1,58 2,75 1,10 2,33 2,49
CD21+ (%) Mediana 50,3 41,3 46,0 46,7 63,6 55,2 0,152
Mínimo 15,5 24,4 19,9 18,8 14,5 39,5
Máximo 87,1 59,2 85,2 89,7 84,7 87,8

*Diferenças estatísticas pelo teste de Friedman (P≤0,05).

Os valores relativos e absolutos para células B CD21+ foram relativamente estáveis durante o período de transição. Não foi possível detectar diferenças entre os momentos para células CD21+ (P≥0,05).

Os valores medianos obtidos para a Hp foram de 166 (43-149), 198 (109-508), 320 (180-6780), 457 (286-1145), 609 (160-1009) e 576 (251-940) µg/mL, respectivamente, entre as semanas -2 e +3 (P=0,000). As comparações múltiplas entre os momentos revelaram que os valores obtidos na semana +1 eram diferentes daqueles obtidos nas semanas -1 e +3 (P≤0,0033). As frequências de vacas com concentração de haptoglobina moderada (8,5 - 458µg/mL) e alta (459 - 1757µg/mL) eram de 100 e 0%; 91,67 e 8,33%; 81,82 e 18,18%; 58,33 e 41,67%; 41,66 e 58,34%; 33,33 e 66,67% entre as semanas -2 e +3, respectivamente. As vacas não apresentaram baixas concentrações de haptoglobina (≤8,4µg/mL) ao longo deste estudo (Nightingale et al., 2015).

As concentrações séricas do cortisol ≥1,0µg/dL foram observadas em 25% (3/12) das vacas entre as semanas -2 e -1, entretanto o número de animais com valores acima do ponto de detecção aumentou na parição (11/12, 91,7%). No período pós-parto, a frequência de animais positivos diminuiu para 41,7% (5/12); 33,3% (4/12) e 58,3% (7/12) da semana +1 para a +3, respectivamente. As medianas entre as amostras de cortisol com valores acima de 1,0µg/dL foram de 1,07 (≤1,0-1,25); 1,06 (≤1,0-2,72); 2,11 (≤1,0-4,27); 1,45 (≤1,0-3,81); 1,53 (≤1,0-2,57); 1,97 (≤1,0-2,85) µg/dL entre as semanas -2 e +3, respectivamente.

DISCUSSÃO

O período de transição é marcado por uma série de eventos, como a gestação, o parto, a colostrogênese e a lactogênese, que requerem uma série de adaptações metabólicas para o suprimento dessas demandas fisiológicas. A adaptação das vacas pode ser favorecida pelas condições de criação, caso contrário o desequilíbrio entre a demanda e o consumo pode resultar em cetose e hipocalcemia, estritamente relacionadas à intensificação da imunossupressão relatada para vacas no período de transição. A análise das condições oferecidas às vacas no pré-parto permitiu identificar alguns fatores de risco que podem ter contribuído para a elevada taxa de doenças no rebanho, tais como: 1. bem estar - esta pesquisa foi conduzida em meses quentes do ano (primavera e verão), entretanto a área de sombreamento no piquete pré-parto era escassa; além disso, não havia manejo ou área específica que proporcionassem condições favoráveis à privacidade e ao conforto das vacas durante o trabalho de parto. Os partos das vacas não eram assistidos no período noturno e nos finais de semana, propiciando demora na assistência obstétrica dos casos de distocia. Esses eventos, por si só, podem ter intensificado o estresse das vacas ao redor da parição e justificam o pico de cortisol observado nesse período; 2. em relação à dieta das vacas, pode-se dizer que a relação cálcio e fósforo está desequilibrada (1:2), sendo este um dos fatores que podem ter contribuído para a ocorrência de hipocalcemia clínica. Dados a respeito da concentração de cálcio dessas vacas foram apresentados previamente por Baldacim (2014), observando-se hipocalcemia subclínica ao redor de 70% das vacas na parição e na semana +1. Assim, os fatores de risco presentes no sistema de criação das vacas contribuíram para a elevada taxa de ocorrência de doenças observada a partir da parição.

Corassin et al. (2011) verificaram incidência de hipocalcemia e metrite de 1,7% e 19,5%, respectivamente, enquanto, na presente pesquisa, as taxas foram de 8,3 e 41,7% para as mesmas enfermidades. Esses autores observaram ainda que vacas com retenção de placenta tiveram 3,68 vezes mais chance de apresentarem metrite. No presente estudo, essa relação também existiu: das cinco vacas que apresentaram metrite, três manifestaram doenças prévias, como distocia e retenção de placenta.

Diante do perfil sanitário apresentado pelas vacas, pode-se prever que a dinâmica celular observada ao longo do período de transição foi influenciada por uma série de eventos interconectados: estresse ao redor da parição (pico de cortisol), elevada taxa de doenças a partir da parição e soropositividade das vacas ao BLV.

O pico de cortisol ao redor da parição coincidiu com algumas alterações no leucograma compatíveis com o estresse, exceto para linfócitos (Meglia et al., 2001). O principal evento associado à imunossupressão das vacas ao redor da parição é o efeito negativo do cortisol sobre as subpopulações de linfócitos. Geralmente, observa-se linfopenia decorrente da diminuição da resposta proliferativa, especialmente dos linfócitos T CD3+, diante dos antígenos (Van Kampen e Mallard, 1997; Kimura et al., 2002). Esse perfil foi totalmente alterado nesta pesquisa devido à soropositividade das vacas ao BLV, observando-se linfocitose em razão da elevada proporção de células B CD21+.

O número de linfócitos observado ao redor da parição nas vacas desta pesquisa foi três vezes maior que aqueles relatados para vacas saudáveis (3,58x103células/μL) e semelhante ao valores observados em vacas soropositivas (9,16x103células/μL) por Kaczmarczyk et al. (2004). As proporções de células CD21+ (41,3 - 63,6%) aqui obtidas foram semelhantes à proporção de 58% relatada para vacas lactantes e soropositivas para o BLV (Lewin et al., 1988). Esses valores são superiores às proporções de 24,1; 28,9 e 22,8% encontradas nas semanas -3, parto e +3 por Van Kampen e Mallard (1997), em animais não investigados para BLV. As vacas soropositivas para o BLV apresentam aumento da meia-vida dos linfócitos B devido à diminuição da taxa de apoptose (Souza et al., 2011), entretanto alguns mecanismos efetores da resposta imune envolvendo as células B estarão suprimidos, justificando, assim, a linfocitose como compensatória. Droogmans et al. (1994) encontraram baixa expressão do receptor da interleucina 6 nas células B infectadas pelo BLV. Essa citocina é fundamental para a diferenciação das células B em plasmócitos produtores de anticorpos.

As proporções de linfócitos T auxiliares (4,4-11%) encontrados nesta pesquisa foram muito menores que os intervalos de 24,8-29,8 e 20,1-38,7% relatados por Kimura et al. (2002) e Van Kampen e Mallard (1997), respectivamente. Em contrapartida, as proporções de linfócitos T citotóxicos (7,2-10,6%) foram semelhantes àqueles relatados por Kimura et al. (2002) (8,6-12,3%) e Van Kampen e Mallard (1997) (5,8-11,5%). A baixa proporção das subpopulações de linfócitos T pode ser consequência da menor resposta proliferativa dessas células durante o período de transição sob o efeito de elevadas concentrações de cortisol (Kimura et al., 2002) ou de desequilíbrio na produção de citocinas devido à influência do BLV (Droogmans et al., 1994). Os dados encontrados nesta pesquisa concordam parcialmente com aqueles relatados por Della Libera et al. (2012), que também encontraram maior proporção de células B CD21+ (41,82%) e baixas proporções de linfócitos auxiliares (3,95%) em vacas soropositivas para o BLV que apresentavam linfocitose persistente, porém esses autores também relataram menores proporções de T citotóxicos (6,47%).

A análise das proporções das subpopulações de células T no tempo estudado revelou dois picos para as células CD3+CD4+ e CD3+CD8+ ao redor da parição e entre as semanas +2 e +3. Provavelmente as oscilações observadas decorreram de processos inflamatórios causados pelas doenças relatadas nesta pesquisa e/ou por outras doenças infecciosas. Não houve descrição de mastite clínica nas fichas de controle sanitário da fazenda, porém tal doença não foi investigada. O segundo pico das subpopulações de linfócitos T no pós-parto provavelmente está associado aos episódios de metrite (41,7%).

O aumento da Hp foi gradual da semana -2 à +3, indicando o agravamento da condição patológica do útero das vacas ao longo do estudo. Nightingale et al. (2015) determinaram as concentrações de haptoglobina em vacas sadias no período de transição e as classificaram conforme o valor encontrado em três grupos distintos: low cows, para valores séricos de Hp abaixo de 84µg/mL; moderate cows, para valores obtidos entre 85 e 458µg/mL; e high cows, para valores entre 459 e 1.757µg/mL. Considerando-se os limiares descritos por esses autores, as vacas desta pesquisa pertenceriam ao grupo moderate cows no pré-parto e ao grupo high cows no pós-parto. A resposta imunológica intensa, porém ineficiente, ao BLV promove a alteração no padrão de expressão das citocinas TNF-α, IFN-γ, L-2, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12 em vacas soropositivas (Amills et al., 2004), a qual, aliada às doenças da produção ocorridas no período, justifica a classificação das vacas analisadas nos perfis estabelecidos pelos autores.

Em geral, o perfil de leucócitos e de subpopulações de linfócitos apresentado pelas vacas no período de transição sofreu influência de fatores fisiológicos relacionados à elevada taxa de cortisol ao redor da parição associada ao BLV e às doenças da produção.

CONCLUSÕES

O perfil leucocitário apresentado pelas vacas Holandesas ao redor da parição foi compatível com as elevadas concentrações de cortisol, exceto para linfócitos. A dinâmica das subpopulações de linfócitos B foi compatível com a infecção pelo BLV. As subpopulações de linfócitos T auxiliar e citotóxico foram influenciadas quantitativamente pelo BLV e pelo cortisol, porém as oscilações (picos) observadas foram concomitantes às doenças da produção. Acredita-se que o BLV pode ter sido um dos fatores de risco para a elevada taxa de doenças observadas nas vacas deste estudo.

AGRADECIMENTOS

Esta pesquisa foi financiada pelo CNPq, projeto número 479381/2013.

REFERÊNCIAS

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Recebido: 17 de Março de 2016; Aceito: 21 de Fevereiro de 2017

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