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Ciência Rural

Print version ISSN 0103-8478

Cienc. Rural vol.40 no.8 Santa Maria Aug. 2010  Epub Aug 20, 2010

https://doi.org/10.1590/S0103-84782010005000127 

ARTIGOS CIENTÍFICOS
MICROBIOLOGIA

 

Atividade antibacteriana do óleo essencial do manjericão frente a sorogrupos de Escherichia coli enteropatogênica isolados de alfaces

 

Antibacterial activity of essential basil oil against serogroups of enteropathogenic Escherichia coli isolated from lettuce

 

 

André Gustavo Lima de Almeida MartinsI, 1; Adenilde Ribeiro NascimentoI; João Elias Mouchrek FilhoI; Nestor Everton Mendes FilhoI; Antonio Gouveia SouzaII; Natanael Eudes AragãoIII; Diôgo Sérgio Vieira da SilvaI

IDepartamento de Tecnologia Química, Universidade Federal Maranhão (UFMA), Campus Universitário do Bacanga, Av. dos Portugueses, S/N, 65085-580, São Luís, MA, Brasil. E-mail: andremartins1975@yahoo.com.br
IILaboratório de Combustíveis-LACOM, Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa, PB, Brasil
IIIQuímico Industrial, UFMA, São Luís, MA, Brasil

 

 


RESUMO

Considerando-se a crescente participação dos vegetais na transmissão de microrganismos, incluindo as Escherichia coli enteropatogênicas multirresistentes às drogas convencionais, a busca por novos compostos com propriedades antimicrobianas a partir de fontes naturais, tais como os óleos essenciais, tem se intensificado nos últimos anos. Esta pesquisa objetivou avaliar a atividade antibacteriana do óleo essencial do manjericão (Ocimum basilicum Linn.) frente a sorogrupos de Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC) isolados de alfaces (Lactuca sativa), utilizando-se o Método de Difusão em Disco (MDD). Os resultados evidenciaram que todas as cepas de E. coli EPEC testadas apresentaram sensibilidade à ação do óleo essencial, sugerindo que este possa ser uma fonte de compostos com potencial terapêutico no combate a bactérias patogênicas.

Palavras-chave: Escherichia coli EPEC, óleo essencial, manjericão, atividade antibacteriana.


ABSTRACT

Considering the increase of the involvement of vegetables in the transmission of microorganism including the enteropathogenic Escherichia coli multiresistance to conventional drugs, the search for new antimicrobial compounds from natural sources, such as the essential oils, has been intensified in the last years. This research aimed to evaluate the antibacterial activity of the essential oil from basil (Ocimum basilicum Linn.) front to sorogroups of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolated in lettuces (Lactuca sativa) using the Diffusion in Disk Method. The results showed that, all the tested strains of E. coli EPEC presented sensitivity to the essential oil's action, suggesting that it can be a source of compounds with therapeutic potential in the fighting to bacteria pathogenic.

Key words: Escherichia coli EPEC, essential oil, basil; antibacterial activity.


 

 

INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais para o tratamento de doenças está associado à medicina popular de diferentes partes do mundo. Entre os principais produtos de origem vegetal com atividade antimicrobiana estão os extratos e os óleos essenciais (SARTORATTO et al., 2004). Entre as plantas medicinais comumente usadas na medicina popular está o manjericão (Ocimum basilicum Linn.), o qual pertence à família Lamiaceae, possuindo espécies originárias de regiões tropicais e subtropicais da Ásia, da África e da América Central e do Sul (LABRA et al., 2004).

A composição dos óleos essenciais extraídos das folhas e dos ápices com inflorescência do manjericão varia de acordo com a espécie e a localização geográfica, sendo classificados em quatro quimiotipos, de acordo com os componentes majoritários do óleo: quimiotipo linalol-metil chavicol (Europeu), metil chavicol (Reunião), metil cinamato (Tropical) e quimiotipo eugenol (Java). Em função de suas propriedades terapêuticas, o manjericão é amplamente utilizado na medicina popular como antiespasmódico, antitérmico, auxiliando também na digestão e no combate de infecções bacterianas e parasitárias intestinais (TELCI et al., 2006).

A atividade antimicrobiana do óleo essencial do manjericão tem sido relatada como sendo predominantemente associada aos seus constituintes majoritários, o metil chavicol e o linalol. O óleo essencial dessa planta tem sido utilizado nas indústrias de alimentos como flavorizante para produtos de confeitaria, bebidas não alcoólicas, sorvetes e como condimentos e na indústria de cosméticos (BOZIN et al., 2006).

O hábito alimentar da população tem mudado consideravelmente, e o aumento no consumo de hortaliças in natura caracteriza essa mudança. Nesse contexto, a alface (Lactuca sativa) está entre as hortaliças folhosas mais consumidas no Brasil, sendo um dos componentes mais presentes nas saladas dos brasileiros. Seu cultivo é praticado de forma orgânica, livre de pesticidas ou agrotóxicos; hidropônica, em que as hortaliças ficam protegidas contra diversos fatores adversos do meio ambiente, como chuvas, geadas e ventos fortes, favorecendo a produtividade do produto; e convencional, com utilização de defensivos agrícolas (SANTANA et al., 2006).

Segundo FERNANDES et al. (2002), as hortaliças, por serem consumidas in natura, têm sido consideradas como uma das principais veiculadores de microrganismos patogênicos de interesse em Saúde Pública. Esses autores relatam ainda que as principais fontes de contaminação de hortaliças são a água de irrigação, que pode apresentar uma grande quantidade de contaminantes, como ovos de helmintos, cistos de protozoários e coliformes de origem fecal, e o esterco animal, utilizado como adubo orgânico. Entre as principais espécies de bactérias contaminantes de hortaliças está a Escherichia coli, por apresentar linhagens patogênicas produtoras de toxinas, tais como: hemolisinas, enterotoxinas termolábeis (LT) e termoestáveis (ST) e Shiga-toxina e estar frequentemente associada a surtos de toxinfecções alimentares. E. coli enteropatogênicas (EPEC), apesar de não produzirem Shiga ou verotoxinas, estão entre as linhagens de E. coli diarreiogênicas (KAPER et al., 2004).

Considerando-se a relevância e atualidade do problema no Brasil e a crescente participação das hortaliças na transmissão de E. coli enteropatogênicas, esta pesquisa teve por objetivo avaliar a atividade antibacteriana do óleo essencial do manjericão (Ocimum basilicum L.) frente a sorogrupos de E. coli enteropatogênica (EPEC) isolados de alfaces (Lactuca sativa) orgânicas e hidropônicas comercializadas em feiras livres e supermercados da cidade de São Luís, Maranhão (MA).

 

MATERIAL E MÉTODOS

Coletas das amostras

Foram coletadas 100 amostras de alfaces (variedade crespa) cultivadas em sistemas orgânico e hidropônico e comercializadas em feiras livres e supermercados, respectivamente, localizados na cidade de São Luís/MA, no período de maio a julho de 2009. A escolha dessa hortaliça se justifica pelo fato de estar entre as mais consumidas pela população maranhense. A opção pelos sistemas de cultivo baseou-se no fato de fornecerem alimentos mais saudáveis, ou seja, livres de agrotóxicos e/ou pesticidas. Após coletadas, as amostras foram acondicionadas em caixas isotérmicas e transportadas ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água da Universidade Federal do Maranhão para a realização das análises pertinentes.

Isolamento e identificação das cepas de Escherichia coli

Para o isolamento e a identificação da E. coli, utilizou-se a técnica descrita por KORNACKI & JOHNSON (2001). Para tanto, foram pesados assepticamente 25g de cada amostra, que foram incubados em 225mL de Caldo Infusão Cérebro Coração (Caldo BHI) a 37°C, por três horas. Após o período de incubação, foram acrescentados ao inóculo 250mL de Caldo Escherichia coli (Caldo E.C.), com posterior incubação a 37°C, por 24 horas. O plaqueamento seletivo foi realizado nos Agares Eosina Azul de Metileno (EMB) e MacConkey Sorbitol. Após a incubação, as colônias típicas de E. coli foram submetidas à identificação bioquímica utilizando-se o Sistema API-20E (bioMérieux).

Identificação sorológica das cepas de Escherichia coli

Para a identificação sorológica de E. coli enteropatogênicas (EPEC), foram utilizados soros polivalentes e monovalentes (Probac do Brasil®) contendo anticorpos para a identificação de antígenos somáticos O, a saber: soro polivalente A contendo anticorpos, para a identificação dos sorogrupos monovalentes: O26, O55, O111 e O119; polivalente B, para identificar os monovalentes: 114, O125, O142 e O158; e polivalente C, para os monovalentes: O86, O126, O127 e O128, segundo metodologia descrita por MENG et al. (2001). Para a realização dos testes sorológicos, 1mL de água estéril foi adicionado às culturas de 24 horas para a obtenção de uma suspensão. Em seguida, foram retiradas alíquotas de 0,1mL das respectivas suspensões e adicionadas à superfície de uma lâmina de vidro limpa e seca. Primeiramente, as cepas de E. coli foram testadas para os soros polivalentes A, B e C para E. coli EPEC clássica e em seguida para os soros monovalentes, de acordo com a classificação obtida nos soros polivalentes. A prova sorológica positiva consistiu da aglutinação do soro após a sua adição na suspensão da cultura bacteriana em estudo.

Extração do óleo essencial

Para a extração do óleo essencial do manjericão, foram utilizadas as folhas da planta. A extração foi realizada pelo processo de hidrodestilação usando-se o extrator de Clevenger, segundo metodologia descrita por MATOS (1997).

Análise cromatográfica

Para a identificação dos constituintes do óleo essencial do manjericão, utilizou-se a técnica de Cromatografia a Gás acoplada à Espectrometria de Massas (CG/MS) nas seguintes condições: Equipamento: CG\EM, modelo QP - 5000, fabricado pela Shimadzu; Método: OE_1.met; Amostras: inicialmente pesou-se 1,0mg de cada amostra e dissolveu-se em 1000µL de diclorometano (pureza 99,9%); Volume injetado: 0,3µL; Coluna: Capilar, 30mx0,25mmx0,25µm. HP-5MS, 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano (Equivalente DB-%MS ou CP-Sil 8CB LB\MS); Gás de arraste: He (99,9995%); fluxo: 1,0mL min-1; Injetor: 280°C, modo Split (1:10); Forno: 40°C (5,0min) 240°C (4°C min-1); 240°C 300°C (8°C min-1, 7,5min); tT=60,0min; Detector: EM; EI (70 eV); Espectrômetro de massas tipo quadrupolo linear. Modo de varredura (0,5s sacn-1); Faixa de massas: 40-500 daltons; Linha transferência: 280°C; e Filamento: desligado 0,0 a 4,0min. Para a identificação dos compostos detectados nas amostras, utilizaram-se as bases de dados de espectros de massas NIST105, NIST21 e WILEY139.

Antibiograma

Para a avaliação da atividade antibacteriana do óleo essencial do manjericão, utilizou-se o Método de Difusão em Disco (MDD), segundo metodologia recomendada pelo NCCLS (2000). Para esse teste, as amostras de E. coli EPEC, isoladas das alfaces, foram cultivados em Caldo BHI (37°C/24 horas) e, após o período de incubação, foram realizadas diluições sucessivas para a obtenção da turbidez de 0,5 na escala de MacFarland (108UFC mL-1). De cada cultura, retirou-se uma alíquota de 0,1mL e inoculou-se na superfície do Agar Müeller-Hinton, sendo utilizado um suabe para espalhar o inóculo. Em seguida, os discos (6mm) impregnados com 75µL do óleo essencial foram colocados no centro da placa com o auxílio de uma pinça. As placas foram incubadas a 37°C, por 24 horas. A leitura dos halos de inibição foi feita com o auxílio de uma régua milimetrada.

Como parâmetro para a atividade antibacteriana do óleo essencial do manjericão, foram utilizados os padrões de sensibilidade adotados por MOREIRA et al. (2005), os quais classificaram a atividade de diferentes óleos essenciais de acordo com o tamanho do halo de inibição, a saber: não sensível: (-) para diâmetros 8mm; sensível: (+) para diâmetros de 9-14mm; muito sensível: (++) para 15-19mm; extremamente sensível: (+++) para os halos com diâmetros 20mm.

Análise estatística

Para a avaliação do efeito inibitório do óleo essencial do manjericão frente aos sorogrupos de E. coli EPEC, os dados experimentais foram submetidos ao teste paramétrico para a diferença entre duas médias populacionais (amostras pequenas e independentes) e com um nível de significância de 5%, sendo utilizado o software STATISTICA 7.0. Esse teste foi realizado supondo-se que as variâncias populacionais α12 e α22 são desconhecidas e estimadas por meio de pequenas amostras (n30); com n1+n2-2 graus de liberdade. Nesse caso, o critério de decisão para testar a hipótese nula µ1-µ2=d0 foi baseado no teste t-Student, considerando-se que as populações são aproximadamente normais.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados referentes à frequência e ao percentual de isolamento de E. coli enteropatogênicas (EPEC) das amostras de alfaces cultivadas pelos sistemas orgânico e hidropônico estão expressos na tabela 1. De acordo com os resultados, independentemente do sistema de cultivo (orgânico ou hidropônico), foram identificados, por meio dos testes sorológicos para E. coli enteropatogênica clássica EPEC, em ambas as amostras de alface, os sorogrupos: O55, O111, O114, O125, O127 e O142.

No Brasil, estima-se que as diarréias sejam as responsáveis por mais de 200.000 óbitos anuais de crianças, nos quais a EPEC se encontra entre as principais causas. A infecção por EPEC é transmitida principalmente pelo consumo de água ou alimentos contaminados, sendo o problema agravado quando há imunodreprimidos (TRABULSI et al., 2002).

Diversos surtos de toxinfecções alimentares têm sido associados com hortaliças contaminadas. Pesquisadores têm recuperado várias bactérias patogênicas para humanos desses produtos, tais como Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e E. coli O157:H7 cultivadas em ambos os sistemas de produção - orgânico e hidropônico. Entre as principais fontes de contaminação das hortaliças por linhagens de E. coli enteropatogênicas estão o esterco, utilizado com adubo orgânico, e a água de irrigação contaminada, utilizada no sistema de produção orgânico, bem como a manipulação, os nutrientes e a água contendo material fecal na produção hidropônica (McMAHON & WILSON, 2001). SAFARIKOVÁ & SAFARIK (2001), ao avaliarem a contaminação de amostras de hortaliças, incluindo a alface, constataram a contaminação destas por sorogrupos de E. coli O26, O111 e O157.

A análise por CG/EM do óleo essencial do manjericão estudado nesta pesquisa identificou seis componentes como sendo os principais constituintes do óleo com um percentual de abundância significativo, a saber: o metil chavicol ou estragol [1-metoxi-4-(2-propenil)-benzeno] (62,39%), linalol (25,88%), -farneseno (6,14%), 1,8 cineol (eucaliptol) (3,48%), -terpineol [4-metil-1-(1-metiletil)-3-ciclohexen-1-ol] (1,43%) e -cadinol (0,67%).

Nesta pesquisa, sorogrupos de E. coli EPEC isolados das amostras de alfaces foram testados frente à ação antibacteriana do óleo essencial do manjericão, em que as características numéricas obtidas a partir do antibiograma realizado com o óleo essencial estão apresentadas nas tabelas 2 e 3. De acordo com os resultados, os sorogrupos de E. coli EPEC testados demonstraram sensibilidade (+) frente à ação do óleo essencial do manjericão, com médias de halos de inibição variando entre 11,2mm e 11,6mm e de 11,0mm a 12,0mm para os isolados das alfaces orgânicas e hidropônicas, respectivamente. Após a análise estatística aplicada a esses resultados com a finalidade de comparar as médias dos halos de inibição, não foram constatadas diferenças significativas (P 0,05) entre as cepas de E. coli EPEC sensíveis ao óleo de manjericão.

O efeito inibitório apresentado pelo óleo do manjericão observado nesta pesquisa foi atribuído à presença do metil chavicol e linalol, os constituintes majoritários do óleo. Esse resultado é semelhante aos achados de WAN et al. (1998), quando avaliaram a ação antibacteriana do óleo essencial dessa espécie frente a uma variedade de bactérias gram positivas e gram negativas, incluindo a E. coli. Os resultados aqui apresentados concordam ainda com os achados por DUARTE et al. (2007), os quais, estudando o efeito de óleos essenciais de plantas medicinais usadas no Brasil, incluindo o manjericão, frente a E. coli enteropatogênicas (EPEC) e E. coli enterotoxigênicas (ETEC), classificaram a atividade antibacteriana do óleo essencial do manjericão como sendo de atividade moderada.

HUSSAIN et al. (2008) relataram a ação do óleo essencial de manjericão frente à Escherichia coli, a qual demonstrou sensibilidade ao apresentar um halo de inibição de 11,4mm. BOZIN et al. (2006), caracterizando a composição dos constituintes voláteis dos óleos essenciais de algumas espécies da família Lamiaceae, bem como a sua atividade antimicrobiana, verificaram um halo de inibição de 11mm de diâmetro para o manjericão frente a E. coli multirresistentes a antibióticos comerciais. Os autores atribuíram o efeito inibitório à presença dos constituintes majoritários do óleo, o metil chavicol e o linalol.

SOKOVIC & VAN GRIENSVEN (2006) comentaram que o manjericão tipo metil chavicol apresentou significante atividade contra o crescimento de diferentes microrganismos, incluindo a E. coli, resultados que corroboram os achados nesta pesquisa. Os referidos autores relataram ainda que a atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjericão pode ser atribuída ao linalol e a outros compostos oxigenados.

 

CONCLUSÃO

O teste in vitro do óleo essencial do manjericão testado frente a diferentes sorogrupos de E. coli EPEC clássica mostrou atividade antibacteriana significante, sugerindo que este pode ser utilizado como uma alternativa no combate as toxinfecções causadas por E. coli. Porém, o potencial uso desse óleo como fitoterápico no tratamento de doenças infecciosas necessita de avaliação in vivo e de novas pesquisas excluindo possíveis efeitos colaterais para a fisiologia digestiva e microbiota normal de indivíduos infectados.

 

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Recebido para publicação 21.09.09
Aprovado em 21.06.10
Devolvido pelo autor 28.07.10
CR-2539

 

 

1 Autor para correspondência.

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