OCORRÊNCIA DE ASPERGILLUS SPP., PENICILLIUM SPP. E AFLATOXINAS EM AMOSTRAS DE FARINHA DE MILHO UTILIZADAS NO CONSUMO HUMANO, PIAUÍ, BRASIL

OCCURRENCE OF ASPERGILLUS SPP., PENICILLIUM SPP. AND AFLATOXINS IN CORN FLOUR SAMPLES USED IN HUMAN CONSUMPTION, PIAUÍ, BRAZIL

RESUMO

Esse trabalho teve como objetivo avaliar a presença de fungos e de aflatoxinas em um produto à base de milho, destinado ao consumo humano na Cidade de Teresina, Piauí, Brasil. Foram utilizadas 30 amostras (500 g) de farinha de milho a partir de seis diferentes marcas vendidas em supermercados dessa cidade. A coleta foi realizada entre janeiro e março de 2009. A avaliação micológica foi realizada imediatamente e, em seguida, foram armazenadas a -4º C, alíquotas para, posteriormente, ser realizada a análise de aflatoxinas. As contagens fúngicas variaram entre 2,42 e 4,10 UFC/g. Não houve diferença significativa a p < 0,05 entre as marcas utilizadas. As principais espécies de Aspergillus isoladas foram: A. flavus (32,73 %), A. oryzae ( 14,54%). A. niger agregado (10,91%), A. parasiticus (5,45%), A. fumigatus (5,45%) e A. carbonarius (1,81%), já as de Penicillium foram P. citrinum (28,88%), P. funiculosum (25,67%) e P. verrucosum (16,22%). Não foi detectada a presença de aflatoxina. Conclui-se que espécies fúngicas potencialmente capazes de produzir micotoxinas como Aspergillus e Penicillium são encontradas em farinha de milho, porém, não foi detectada a presença de aflatoxinas nesse produto utilizado para alimentação humana.

PALAVRAS-CHAVE Micotoxinas; fungos; massa de milho

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the presence of fungi and aflatoxin in a corn product intended for human consumption in the city of Teresina, Piauí, Brazil. Thirty corn flour samples (500 g) from six different trademarks were purchased from local supermarkets in the city of Piaui, Brazil, from January to March 2009. The mycological evaluation was performed immediately, and then aliquots were stored at -4° C, until the aflatoxins analysis. Fungal counts ranged between 2.42 and 4.10 CFU/g. There was no significant difference at p < 0.05 between the brands used. The main Aspergillus species isolated were A. flavus (32.73%), A. oryzae (14.54%). A. niger aggregate (10.91%), A. parasiticus (5.45%), A. fumigatus (5.45%) and A. carbonarius (1.81%), while the Penicillium were P. citrinum (28.88%), P. funiculosum (25.67%) and P. verrucosum (16.22%). No aflatoxins were detected by thin-layer chromatography in corn flour samples. The fungal species potentially capable of producing mycotoxins such as Aspergillus and Penicillium are found in corn flour, but no aflatoxin was found in this kind of product.

KEY WORDS Mycotoxin; fungi; corn flour

Brasil, o milho (Zea mays) é o segundo grão mais produzido (Companhia..., 2010). Destaca-se por ser utilizado tanto na alimentação humana como na alimentação animal. Seus derivados tem efetiva participação na dieta alimentar das camadas mais pobres da população (Melo Filho; Richetti, 1997).

Os fungos encontram-se amplamente distribuídos no meio ambiente, sendo contaminantes frequentes dos alimentos, especialmente os de origem vegetal. Algumas espécies podem invadir e colonizar os tecidos vegetais durante as etapas da produção: no cultivo, na colheita, na secagem, no transporte, no processamento e no armazenamento (Rodriguez-Amaya; Sabino, 2002).

Os gêneros Aspergillus e Penicillium são considerados fungos de armazenamento. Contaminam cereais como: milho, trigo, sorgo, nozes, sementes de algodão e trigo usados na formulação de alimentos (Rodriguez-Amaya; Sabino, 2002). Sua capacidade de crescer em altas temperaturas e baixa atividade de água os faz colonizadores de vários cultivos (Moss, 1991). Algumas espécies do gênero .spergillus são importantes produtores de micotoxinas, como: aflatoxinas (AFs), ocratoxinas (OTA), dentre outras (Klich; Pitt, 1994). Dentro do gênero Penicillium há espécies que produzem uma grande variedade de micotoxinas, sendo algumas delas o ácido ciclopiazónico e penicílico, citreoviridina, citrinina, ocratoxina A, patulina, roquefortina e outras (Pitt; Hocking, 1997). Estas micotoxinas consumidas regularmente, em quantidades mínimas, causam lesões irreversíveis no rim, fígado, cérebro e também podem apresentar atividade teratogênica (Counsil..., 2003).

As Aflatoxinas são micotoxinas produzidas, principalmente por A. flavus e A. parasiticus, estas espécies são habitantes de solo, sendo essa a principal fonte de inóculo. São capazes de crescer em vários tipos de cereais, principalmente em milho e amendoim (Rodriguez-Amaya; Sabino, 2002). Dentro das aflatoxinas a aflatoxina B₁ é a mais importante e classifica-se como potencial carcinogênico humano (Iarc, 2006).

Visando o abordado, este trabalho teve como objetivo avaliar a presença de fungos e de aflatoxinas em um produto à base de milho, destinados ao consumo humano na Cidade de Teresina, Piauí, Brasil.

Foram utilizadas 30 amostras (500 g) de farinha de milho de seis diferentes marcas vendidas em supermercados da Cidade de Teresina, Brasil. O período de coleta foi entre janeiro e março de 2009. Após a coleta as amostras foram homogeneizadas, mescladas e quarteladas para se obter amostras de 100 g para o laboratório. A avaliação micológica foi realizada imediatamente, e alíquotas foram armazenadas para a análise de aflatoxinas.

Foram adicionados 25 g de cada amostra a 225 mL de água peptonada 0,1%, assim formando a diluição de 10^-1; esta mistura foi homogeneizada e diluída para concentrações finais de 10^-2 e 10^-3. Foram espalhados 0,1 mL de cada diluição (por duplicado) na superfície do meio sólido, ágar dicloran-rosa bengala-cloranfenicol (DRBC) (Abarca et al., 1994). As placas foram incubadas durante 7 dias a 25º C. Todas as placas contendo 10 -100 UFC foram contadas, e os resultados expressos em unidades formadoras de colônias (UFC) por grama de amostra. No último dia de incubação, as colônias de Aspergillus e Penicillium, após identificação microscópica, de acordo com critérios propostos por Pitt; Hocking (1997), foram transferidas para ágar extrato de malte (MEA) e incubadas a 25º C por 7 dias para posterior identificação da espécie.

Para a identificação de Penicillum, as colônias foram cultivadas em ágar Czapek yeast (CYA) em 5, 25 e 37º C, MEA a 25º C e 25% de ágar nitrato de glicerol (G25N) a 25º C. Para a identificação de Aspergillus, as culturas são cultivadas em CYA (25 e 37 ºC), MEA (25º C) e extrato de levedura Czapek ágar, com 20% de sacarose (CY20S) a 25 ºC. Todas as placas foram incubadas por 7 dias. Cada cepa foi identificada de acordo com os métodos fornecidos por Pitt (1988) e Klich; Pitt (1994).

As análises de aflatoxinas foram realizadas por cromatografia em camada delgada (CCD), seguindo a metodologia descrita nos métodos oficiais de análise (Association..., 1995). Para cada amostra (25 g) foi utilizado para extração 125 mL de metanol: água (60: 40 v/v), 80 mL de hexano, 2 g de NaCl e homogeneizado por 30 min em um agitador orbital. A mistura foi filtrada através de filtro de papel Whatman fase aquosa Nº 4 (Whatman, Inc., Clifton, New Jersey, E.U.A.) e 25 mL de metanol filtrado: foi extraída duas vezes com 25 e 15 mL de clorofórmio, respectivamente. A fase clorofórmica foi seca a vácuo usando um evaporador rotativo e o extrato foi redissolvido em 200 µL de clorofórmio: acetona (9:1 v/v). Foram aplicados volumes de 2, 5 e 10 ?L de cada extrato, juntamente com a solução padrão de toxina em uma cromatoplaca de sílica gel G60 (20 x 20 cm, Merck, Alemanha). O sistema foi desenvolvido com clorofórmio: acetona (90: 10 v/v). Os cromatogramas foram secos e observados em 365 nm de luz UV. As aflatoxinas foram quantificadas por comparação visual com luz ultravioleta.

Os resultados das contagens foram transformados em log_10, correlacionados e realizada a análise de variância seguida de teste para a comparação de média, SNK, com significância (p < 0,05), utilizando o Pacote Estatístico SIGMA STAT (1994).

A contagem fúngica foi feita por meio de enumeração de propágulos fúngicos e expressa por unidades formadoras de colônia por grama de amostra analisada (UFC/g) (Tabela 1). As contagens fúngicas variaram entre 2,42 e 4,10 UFC/g. Não houve diferença significativa a p < 0,05 entre as diferentes marcas de farinha de milho analisadas.

Tabela 1
Contagem total de fungos filamentosos isolados de diferentes marcas farinhas de milho utilizadas no consumo humano.

Marcas	Contagens fúngicas (médias) em log10 UFC/g	Variaçao em log10 UFC/g
A	3,25	2,73 - 3,88
B	3,15	2,87 - 3,37
C	3,37	2,88 - 4,10
D	2,90	2,42 - 3,52
E	3,14	2,57 - 3,73
F	3,17	2,61 - 3,58

• (P = 0.30), UFC/g= unidade formadora de colônias por grama em log₁₀.

Em trabalho realizado por Pittner et al. (2007), com amostras de farinha de milho do Estado do Paraná, todas as amostras apresentaram valores inferiores a 1,70 UFC/g de fungos, valores bem inferiores quando comparados com os obtidos nesse trabalho, e com o de Alhadas et al. (2004) trabalhando com fubá. A presença de fungos nos alimentos leva a modificações nas características organolépticas, levando a uma significativa diminuição da qualidade (Cast, 2003).

A Tabela 2 mostra a ocorrência de fungos filamentosos isolados de farinha de milho adquiridas em estabelecimentos comerciais de Teresina, PI. Todas as marcas analisadas apresentaram contaminação por diferentes gêneros fúngicos, alguns potencialmente capazes de produzir micotoxinas, o que pode representar um risco potencial para a saúde humana. Foram isoladas 211 colônias fúngicas, no qual ficaram distribuídas em 8 gêneros fúngicos. O gênero mais frequente foi Aspergillus spp. e seus teleomorfos (36,48%), seguido do gênero Penicillium spp. (35,04%) e Fusarium spp. (15,64%). Resultados semelhantes foram encontrados por Ribeiro et al. (2003) e Santos et al. (2008). Em outro trabalho com a mesma matriz encontraram Penicillium spp. como gênero prevalente (Pittner et al., 2007).

Tabela 2
Ocorrência (%) de fungos filamentosos isolados de farinha de milho adquiridas em estabelecimentos comerciais de Teresina, PI.

Gênero Fúngico	N° de isolados	Ocorrência (%)
Aspergillus spp. e teleomorfos	77	36,48
Penicillium spp.	74	35,04
Fusarium spp.	33	15,64
Cladosporium spp.	14	6,63
Mucorales	09	4,26
Absdia	02	0,95
Rhizopus	01	0,47
Curvularia	01	0,47
Total	211,0	100,0

O gênero Aspergillus e Penicillium são indicadores de deterioração em sementes e grãos causando danos ao gérmen, descoloração, alterações nutricionais, perda da matéria seca e os primeiros estágios da deterioração microbiológica (Sinha; Sinha, 1992).

Acredita-se que a grande incidência de contaminação por fungos em alimentos a base de milho seja decorrente das condições de manejo, processamento e armazenamento da matéria prima.

Das 77 cepas de Aspergillus spp. isoladas, 22 pertencem ao gênero Eurotium. A espécie mais isolada foi a de A. flavus correspondendo a 32,73 %, seguido por A. oryzae (14,54%). As frequências relativas das espécies A. niger agregado (10,91%), A. parasiticus (5,45%), A. fumigatus (5,45%) e A. carbonarius (1,81%) foram baixas, porém`, a presença de tais espécies é significativa, pois são potencialmente produtores de micotoxinas (Abarca et al., 2001). Outras espécies de Aspergillus foram identificadas com uma menor frequência como: A. terreus, A. fumigatus, A. ostianus, A. clavatus, A. candidus, A. albicans, A. versicolor e A. peniciloides.

Foram constatadas 13 espécies de Penicillium dentro de um total de 74 cepas, onde a de maior frequência foi P. citrinum (28,88%) seguida por P. funiculosum (25,67%) e P. verrucosum (16,22%). Outras espécies também foram identificadas numa menor frequência como: P. niaksomani, P. citrionigrum, P. miniluteum, P. oxalicum, P. implicatum, P. restrictum, P. purpurogenum, P. raistriki, P. canascens e P. fellutanum. Ribeiro et al. (2003) também evidenciaram a predominância da espécie Penicillium funiculosum. Penicillium citrinum é uma das espécies mais frequentemente encontrada nos alimentos brasileiros, sendo potencialmente produtora de citrinina, uma toxina nefrotóxica (Oliveira et al., 2007).

Já foram relatadas altas incidências de toxinas em alimentos em produtos à base de arroz, trigo e derivados de milho, no qual foi constatado presença de aflatoxinas, zearalenona, ocratoxina e zearalenona (Oliveira et al., 2002). Apesar de encontrar uma alta incidência de fungos na farinha de milho, não foram detectadas aflatoxinas; estes resultados concordam com os obtidos por Caldas; Silva (2007), que analisaram 101 amostras de produtos à base de milho e com outros estudos conduzidos no Brasil (Kawashima; Soares, 2006; Bittencourt et al., 2005).

Reduzir a infecção fúngica nos alimentos destinados ao consumo humano é de essencial importância para evitar as perdas na produção de farinha de milho e também ao risco sanitário para o homem. Essas condições podem ser conseguidas melhorando as condições de armazenamento da matéria-prima, até a comercialização do produto final.

Gêneros fúngicos potencialmente produtores de micotoxinas como Aspergillus e Penicillium são encontrados em farinha de milho, porém não foi detectada a presença de aflatoxina nesse alimento utilizado na alimentação humana.

REFERÊNCIAS

• ABARCA, M.L.; BRAGULAT, M.R.; CASTELLA, G.; CABAÑES, F.J. Mycoflora and aflatoxin-producing strains in animal mixed feeds. Journal of Food Protection, v.57, n.3, p.256-258, 1994.
• ABARCA, M.L.; BRAGULAT, M.R.; CASTELLA, G.; CABAÑES, F.J. Current importance of ochratoxin A-producing Aspergillus spp. Journal of Food Protection, v.64, p.903-906, 2001
• ALHADAS, R.V; STUART, R.M.; BEUX, M.R; PIMENTEL, I.C. Contagem de Bolores e leveduras em fubá e identificação de gêneros potencialmente toxigênicos. Visão Acadêmica, v.5, n.2, p.79-82, 2004.
• ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTRS. Gaithersburg, in Sec. 972-26, 976-22. Off. Methods Anal. 1995.
• BITTENCOURT, A.B.F.; OLIVEIRA, C.A.V.; DILKIN, P.; CORRÊA, B. Mycotoxin occurrence in cornmeal and flour traded in São Paulo, Brazil. Food Control, v.16, p.117-120, 2005.
• CALDAS, E.D.; SILVA, A.C.S. Mycotoxins in corn-based products consumed in Brazil: an exposure assessment for fumonisins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.55, p.7974-7980, 2007.
• COPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO. (Brasil). A Safra de grãos supera anterior em 8,7%. Disponível em: <http://www.conab.gov.br/conabweb/index.php?PAG=73&NSN=1309> Acesso em: 12 dez. 2010.
  » http://www.conab.gov.br/conabweb/index.php?PAG=73&NSN=1309
• CONCIL FOR AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY - CAST. Micotoxins: riskc in plant, animal and humans systems. Ames: CAST, 2003. 109p.
• INTERNATIONAL AAGENCY FOR RESEARCH ONCANCER. IARC monographs. Disponível em: <http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/ListagentsCASnos.pdf>. Acesso em: 2006.
  » http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/ListagentsCASnos.pdf
• KAWASHIMA, L.M.; SOARES, L.M.V. Occurrence of fumonisin B1, aflatoxins B1, B2, G1, and G2, ochratoxin A and zearalenone in corn products. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.26, p.516-521, 2006.
• KLICH, M.A.; PITT, J.I. (Ed.). A laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs. Clayton South: Commonwealth Scientific and Industrial Research, 1994.
• MELO-FILHO, G.A.; RICHETTI, A. Aspectos socioeconômicos da cultura de milho. Embrapa, 1997. p.12-21. (Circular Técnica, n.5).
• MOSS, M.O. Mycology of cereal grain and cereal products. In: CHELKOWSKI, J. (Ed.). Cereal grain. Mycotoxins, fungi and quality in drying and storage Ámsterdam: Elsevier, 1991.
• OLIVEIRA, M.S.; PRADO, G.; ABRANTES, F.M.; SANTOS, L.G.; RIALA, T.V. Incidence of aflatoxins, Deoxynivalenol and Zearalenone in products commercialized in the cites of Minas Gerais state in 1998-2000, Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.61, n.1, p.1-6, 2002.
• OLIVEIRA, G.R.; RIBEIRO, J.M.M.; FRAGA, M.E.; CAVAGLIERI, L.R.; DIREITO, G.M.; KELLER, K.M.; DALCERO, A.M.; ROSA, C.A.R. Mycobiota in poultry feeds and natural occurrence of aflatoxins, fumonisins and zearalenone in the Rio de Janeiro State, Brazil. Mycopahologia v.162, p.355-362, 2007.
• PITT, J.I. A Laboratory guide to commom Penicillium species. 2.ed. North Ride: CSIRO Division of Food Processing, 1988. 186p.
• PITT, J.I.; HOCKING, A.D. Fungi an food spoilage London: Blackie Academic & Professional, 1997. 920 p.
• PITTNER, E.; CZERVINSKI, T.; SANCHES, H.F.; MONTEIRO, M.C. Isolamento de fungos em alguns produtos a derivados de milho. Publeatico. UEPG. Ciências Biologicas e da Saúde, v.13, n.1/2, p.21-27, 2007.
• RIBEIRO, S.A.A.L.; CAVALCANTI, M.A.Q.; FERNANDES, M.J.S.; LIMA, D.M.M. Fungos filamentosos isolados de produtos derivados do milho comercializados em Recife, Pernambuco. Revisista Brasieira de Botânica, v.26, n.2, p.223-229, 2003.
• RODRÍGUEZ-AMAYA, D.B.; SABINO, M. Mycotoxins research in Brazil: the last decade in review. Brazilian Journal of Microbiology, v.33, n.1, p.1-11, 2002.
• SANTOS, G.C.; ROCHA, N.S.C.; MIRANDA, M.S.; BARROS, T.F. Ocorrência de fungos toxigênicos em farinhas de milho comercializadas no estado da Bahia-2007/2008. Dados premilinares. Revista Ciências da Vida, v.28, 2008. Suplemento.
• SIGMA STAT for windows version 1.0. Jandel Corporation, 1994.
• SINHA, K.K.; SINHA, A.K. Impact of stored grain pests on seed deterioration and aflatoxin contamination in maize. Journal of Stored Products Research, v.28, n.3, p.211-219, 1992.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Set 2020
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2011

Histórico

• Recebido
  11 Ago 2010
• Aceito
  14 Maio 2011