Aquisição da dependência de gonadotrofinas pelos folículos antrais iniciais e os desafios para promover o seu crescimento in vitro

Resumo

Esta revisão tem como objetivo discutir os principais fatores envolvidos no desenvolvimento de folículos antrais iniciais até a dependência de gonadotrofinas. Essa fase folicular é caracterizada por intensa proliferação de células da granulosa, formação de uma cavidade preenchida por líquido, diferenciação morfológica das células do cumulus, células da granulosa murais e recrutamento de células da teca. A interação entre oócito, células da granulosa e da teca é determinante para o crescimento folicular e produção hormonal. Fatores de crescimento produzidos pelo oócito, fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9) e proteína morfogenética óssea-15 (BMP-15), regulam a proliferação e diferenciação de células da granulosa, e o desenvolvimento da cavidade antral, bem como estimulam a produção de receptores do hormônio folículo estimulante (FSH) nas células da granulosa. Em resposta ao FSH, as células da granulosa secretam o peptídeo natriurético tipo C (CNP), que atua através de seu receptor para aumentar a produção de monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) e consequentemente o desenvolvimento folicular. As células da granulosa também produzem o fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e aumentam a atividade da enzima aromatase, o que resulta em maior sensibilidade às gonadotrofinas e esteroidogênese folicular. A ausência de sinalização do IGF-1 causa cessação do crescimento folicular no início do estágio antral. Muitos outros fatores locais estão envolvidos na regulação do desenvolvimento folicular. Por tanto essa revisão traz dados relevantes para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no controle do crescimento de folículos antrais iniciais, enfatizando o papel dos fatores endócrinos e parácrinos, a interação oócito-células da granulosa e os processos de atresia folicular. Os desafios para o estabelecimento de sistemas de cultivo eficientes para o crescimento in vitro de folículos antrais iniciais também são discutidos.

Abstract

This review aims to discuss the main factors involved in the development of early antral follicles until gonadotropin dependence. This follicular phase is characterized by intense proliferation of granulosa cells, formation of a fluid-filled cavity, morphological differentiation of cumulus cells, mural granulosa cells and recruitment of theca cells. The interaction between oocyte, granulosa and theca cells is crucial for follicular growth and hormone production. Growth factors produced by the oocyte, such as growth and differentiation factor-9 (GDF-9) and bone morphogenetic protein-15 (BMP-15), regulate granulosa cell proliferation and differentiation and antral cavity development, as well as stimulate the production of follicle-stimulating hormone (FSH) receptors in granulosa cells. In response to FSH, granulosa cells secrete C-type natriuretic peptide (CNP), which acts through its receptor to increase cyclic guanosine monophosphate (cGMP) production and consequently follicular development. Granulosa cells also produce insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and increase aromatase enzyme activity, which results in greater sensitivity to gonadotropins and follicular steroidogenesis. The absence of IGF-1 signaling causes cessation of follicular growth at the early antral stage. Many other local factors are involved in the regulation of follicular development. Therefore, this review brings relevant data for a better understanding of the mechanisms involved in the control of early antral follicle growth, emphasizing the role of endocrine and paracrine factors, the oocyte-granulosa cell interaction and the processes of follicular atresia. The challenges for the establishment of efficient culture systems for in vitro growth of early antral follicles are also discussed.

Keywords:
Oocyte; granulosa cells; theca cells; gonadotropins; cumulus cells; folliculogenesis

1. Introdução

A competência oocitária se refere à capacidade do gameta feminino atingir a maturação, ser fertilizado e sustentar o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto(¹). De acordo com Dode et al.(²), esta competência é adquirida gradualmente durante o crescimento folicular pré-antral e antral inicial. Para reforçar esta informação, oócitos de folículos antrais de 3,0 mm são capazes de completar a maturação nuclear in vitro, enquanto aqueles de folículos menores (1,0 e 2,0 mm) apresentam competência reduzida(³,⁴). Essa não competência dos oócitos de pequenos folículos antrais se deve à redução da expressão de genes que ativam vias de sinalização para aumentar a capacidade do oócito de responder ao aumento das gonadotrofinas(⁵). A capacidade de resposta às gonadotrofinas permite que os folículos cresçam até a seleção e dominância (⁶,⁷).

No curso do desenvolvimento folicular, a proliferação e diferenciação morfológica das células da granulosa são de grande importância para preparar o folículo para responder às gonadotrofinas e para criar um ambiente favorável ao desenvolvimento do oócito(⁸). As células da granulosa produzem vários fatores autócrinos e parácrinos que podem estar envolvidos no crescimento do oócito e na formação do antro(⁹). Além disso, os fatores derivados do oócito estimulam a expressão dos receptores do hormônio folículo estimulante (FSHR) nas células da granulosa, para permitir que elas se tornem responsivas às gonadotrofinas (¹⁰). O hormônio folículo estimulante (FSH) induz a proliferação e viabilidade do complexo oócito-cúmulos-granulosa e também pode induzir a diferenciação das células da granulosa (¹¹). Além disso, fatores derivados de oócitos também estimulam a formação da cavidade antral, aumentando a expressão de proteoglicanos, como resultado da interação com o FSH(⁹). Assim, a compreensão dos mecanismos endócrinos, parácrinos e autócrinos que controlam a interação entre as células foliculares e o oócito em folículos antrais iniciais favorece o desenvolvimento de estratégias para promover o seu desenvolvimento in vitro(¹²).

A presente revisão fornece uma visão geral dos principais fatores que controlam o desenvolvimento de folículos antrais iniciais até a dependência de gonadotrofinas, ou seja, regulação da proliferação de células da granulosa, esteroidogênese, atresia, interação entre oócitos e células da granulosa, bem como as estratégias para promover o desenvolvimento de folículos antrais precoces in vitro.

2. Controle endócrino do desenvolvimento do folículo antral inicial

O desenvolvimento folicular desde o estágio pré-antral até o estágio antral inicial é controlado principalmente por reguladores intraovarianos, mas pode ser estimulado pelo FSH. Os receptores específicos para FSH são expressos nas células da granulosa dos folículos secundários e antrais iniciais(¹³). Quando os folículos secundários são formados, as células da granulosa expressam FSHR e as células da teca expressam o receptor do hormônio luteinizante (LHR)(¹⁴). Nas espécies domésticas e humanas, a formação do antro é observada quando os folículos têm cerca de 0,2mm(¹⁵) e tornam-se dependentes de gonadotrofina quando atingem 3,0mm na vaca(¹⁶), 4,0mm na ovelha(¹⁷), 3,0mm na cabra(¹⁸) e 5,0 mm em humanos(¹⁹). O crescimento e maturação folicular além deste estágio, que inclui recrutamento, seleção, dominância e ovulação, é dependente de gonadotrofinas(²⁰,²¹). A aquisição da dependência de FSH durante este intervalo de crescimento é crucial para determinar o destino folicular, isto é, crescimento ou atresia. O peptídeo natriurético tipo C (CNP) é secretado pelas células da granulosa dos folículos secundários e antrais em resposta à estimulação do FSH. O CNP atua através do seu receptor (NPRB) expresso nas células da granulosa dos folículos secundários e aumenta a produção de guanosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cGMP) para estimular o desenvolvimento folicular(³³). Análises de expressão gênica indicaram aumentos nos transcritos para receptores CNP (NPP e NPRB) durante a foliculogênese inicial em camundongos, em associação com aumentos nos peptídeos CNP ovarianos(³³) (Figura 1).

Figura 1.
Fatores que regulam o desenvolvimento dos folículos pré-antrais até os estágios dependentes de gonadotrofinas.

O fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) e a proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15), ambos secretados pelo oócito, promovem a proliferação de células da granulosa e o recrutamento de células da teca, eventos necessários para a transição dos folículos do estágio primário ao secundário(³⁴). Fatores produzidos pelos folículos secundários, incluindo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento transformante (TGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento de fibroblastos 2 e -7 (FGF-2 e FGF-7), BMPs e a ativina são necessárias para a sobrevivência e desenvolvimento folicular adicional. Na fase antral, os peptídeos sintetizados localmente desempenham um papel fundamental na regulação do desenvolvimento folicular, através de mecanismos endócrinos e parácrinos(¹⁷, ³⁵). Dentre esses peptídeos, aqueles do sistema IGF, incluindo IGF-1, IGF-2 e as proteínas de ligação ao IGF (IGFBPs) e alguns membros da família FGF, como FGF-2, FGF-7 (ou KGF), FGF- 8 e FGF-10(³⁵,³⁶), parecem ser críticos para o desenvolvimento folicular em estágio avançado (Figura 1).

Fushii et al.(²²) mostraram recentemente que complexos cumulus-oócitos (CCOs) cultivados com FSH apresentam formação de cavidade antral um dia antes daqueles que não receberam esse hormônio, mostrando a importância do FSH no desenvolvimento folicular. Reguladores intraovarianos, IGF, ativina, fatores derivados de oócitos e proteínas das junções comunicantes desempenham um papel central na aquisição da dependência de FSH no estágio antral inicial do desenvolvimento folicular(¹³). Os andrógenos derivados da teca ligam-se aos receptores de andrógenos (ARs) nas células da granulosa(²³), induzindo assim a expressão de FSHR e o crescimento folicular durante a transição pré-antral para antral(¹⁴, ²⁴, ²⁵). A deficiência de AR no ovário de camundongos induz a apoptose das células da granulosa, interrompe o crescimento do folículo antral e resulta em falência ovariana prematura (²⁶,²⁷,²⁸). Assim, os andrógenos desempenham um papel importante no crescimento, sobrevivência e aquisição da dependência de FSH nos folículos antrais iniciais(¹³) (Figura 1).

O hormônio anti-Mülleriano (AMH) é um produto das células da granulosa a partir de pequenos folículos antrais que tem papel inibitório ou retardador no desenvolvimento dos folículos antrais. O AMH reduz a sensibilidade folicular ao FSH, diminuindo a expressão do FSHR. Inibe o recrutamento cíclico dependente de FSH e parece desempenhar um papel em todo o crescimento folicular independente de gonadotrofinas. Apesar de existir uma relação regulatória entre andrógenos e AMH, não é possível garantir que seus efeitos sejam mediados pelo estradiol, via aromatização da testosterona(²⁹) (Figura 1).

A melatonina é encontrada no fluido folicular dos folículos antrais humanos e tem papéis importantes no controle do desenvolvimento folicular(³⁰). Seus receptores foram previamente detectados em células da granulosa de folículos pré-antrais e antrais(³¹). Em relação aos efeitos da melatonina, Barros et al.(³²) demonstraram que esse hormônio está associado à competência meiótica de oócitos de folículos antrais iniciais. A melatonina mantém a sobrevivência folicular, estimula a formação da cavidade antral e o subsequente crescimento folicular e oocitário, bem como aumenta os níveis de glutationa e de mitocôndrias metabolicamente ativas após cultura in vitro de folículos secundários de ovelhas(³²).

3. Interação oócito-célula da granulosa durante o desenvolvimento de folículos antrais iniciais

É bem sabido que durante o desenvolvimento folicular; membros da família do fator de crescimento transformante beta (TGFβ) e seus receptores estão envolvidos no controle do crescimento de oócitos e proliferação de células da granulosa. Membros da família TGFβ derivados de oócitos, como GDF-9 e BMP-15, regulam a proliferação e diferenciação de células da granulosa, bem como o desenvolvimento da cavidade antral(³³,³⁴). Além disso, estudos recentes indicam que estes fatores regulam a expressão de RNAm para LHR em células do cumulus(³⁵). O GDF-9 derivado de oócitos promove o crescimento de complexos cumulus-oócitos (CCOs), enquanto a BMP-15 induz a expressão do RNAm do receptor de coriogonadotrofina (LHCGR) nas células do cumulus e a expressão do receptor de FSH nos folículos. Tais fatores contribuem para o desenvolvimento folicular e maturação oocitária(³⁵,³⁶). GDF-9 e BMP-15 ligam-se ao receptor BMP tipo II(³⁷) e recrutam quinases semelhantes a ativina do tipo 5 (ALK5)(³⁸) e 6 (ALK6)(³⁹) para, em seguida, regular proteínas SMAD em células da granulosa. Estudos indicam que o GDF-9 aumenta o crescimento e a diferenciação dos folículos pré-antrais em cultivo(⁴⁰) e promove a biossíntese e proliferação de andrógenos nas células da teca(⁴¹). Além desses fatores, a proteína R-espondina2 também é um importante fator parácrino que pode promover a proliferação de células da granulosa(⁴²). O FGF-2 e seus respectivos receptores também estão envolvidos no desenvolvimento inicial dos folículos antrais(³⁶, ⁴³, ⁴⁴). O FGF-2 sozinho ou em associação com VEGF-A influencia a esteroidogênese e a proliferação de células da granulosa de búfalos, regulando a expressão de RNAm do citocromo P450 19A1 (CYP19A1), antígeno nuclear de proliferação célular (PCNA) e proteína X associada a Bcl-2 (BAX)(⁴⁴,⁴⁵) (Figura 2). Além disso, Mattar et al.(⁴⁶) relataram que o VEGF-A e o FGF-2 promovem a formação de redes de células endoteliais durante o cultivo in vitro de células da teca, tais estruturas apoiam o desenvolvimento folicular sucessivo até o estágio pré-ovulatório.

Figura 2.
Interações oócito-células da granulosa durante o desenvolvimento inicial dos folículos antrais.

As células da granulosa desempenham um papel no desenvolvimento dos folículos antrais, promovendo o desenvolvimento do complexo oócito-células da granulosa e fornecendo trifosfato de adenosina (ATP) aos oócitos(⁴⁸). Além disso, Yang et al.(⁴⁸) demonstraram a influência do BPM-4, derivado de células da teca, na esteroidogênese em folículos antrais iniciais. O CNP também é um fator estimulante para folículos antrais iniciais(³⁰) (Figura 2). Em associação com as células da granulosa, as células da teca contribuem para a síntese da inibina α; que é um hormônio que inibe a produção de FSH(⁴⁹). Yang et al.(⁴⁸) demonstraram a influência do BPM-4, proveniente das células da teca, na esteroidogênese e nos folículos antrais iniciais.

4. Controle da proliferação de células da granulosa e produção de estradiol durante o desenvolvimento de folículos antrais iniciais

Nos folículos antrais iniciais, as células da granulosa são altamente proliferativas, mas suscetíveis à apoptose. Os fatores secretados pelo oócito, como GDF-9 e BMP-15, regulam a proliferação e sobrevivência das células da granulosa(⁵⁰,⁵¹). Além disso, a proliferação de células da granulosa depende da ciclina D2 para ativar os membros da família CDK2, CDK4 e CDK6 da quinase dependente de ciclina (CDK)(⁵²). Nos folículos em desenvolvimento, o FSH estimula a proliferação das células da granulosa e a aromatização de andrógenos em estrogênios. Os estrogénios também estimulam a proliferação das células da granulosa(⁵³). Um aumento no estradiol está associado a um aumento na expressão de genes para aromatase, 3β-HSD e receptores para FSH e LH nas células da granulosa (Figura 2)(⁵⁴).

O neuropeptídeo neuronal Y (NPY) está fortemente presente nas células da granulosa e a abundância de mRNA para o NPY é maior nos folículos antrais iniciais do que nos folículos antrais tardios. Além disso, o NPY aumenta a proliferação de células da granulosa através do receptor NPY Y5 (NPY5R) e da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK)(⁵⁵). Baddela et al. (⁵⁶) relataram que, nas células da granulosa, o fator 1 indutível por hipóxia (HIF1) regula transcricionalmente genes associados à esteroidogênese, como proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR), 3B-hidroxiesteróide desidrogenase (HSD3B) e CYP19A1) e proliferação (CCND2 e PCNA). O início da expressão do mRNA do StAR ocorre em folículos antrais iniciais de 1,0 mm de diâmetro(⁵⁷). Além disso, FSH e LH, juntamente com citocinas intraovarianas, induzem a expressão de enzimas esteroidogênicas em células da granulosa, incluindo StAR, CYP11a1, 3βHSD e CYP19a1, como mostra a Figura 3 (⁵⁸). A expressão de RNAm para LHR é encontrada em células da granulosa de folículos menores que 5 mm (⁵⁹).

Figura 3.
Influência do FSH, LH estradiol e IGF-I nas células da granulosa na promoção da proliferação e produção de enzimas envolvidas na esteroidogênese.

O potencial esteroidogênico folicular envolve uma série extensa e altamente coordenada de estágios de desenvolvimento. Durante esse processo, após intensa proliferação das células da granulosa e da teca (até 100 vezes), elas se diferenciam em células endócrinas especializadas. Os esteroides ovarianos são sintetizados pela cooperação dessas células. As células da teca sintetizam andrógenos através da atividade enzimática do citocromo P450 17A1 (CYP17A1) (⁵³). Folículos maiores que 2 mm de diâmetro expressaram fortemente mRNAs de LH-R e CYP17A1 na maioria das células da teca (⁵⁵). Os andrógenos são então convertidos em estrogênios pela aromatase (CYP19) produzida pelas células da granulosa. Além disso, a progesterona é produzida pelas células da granulosa e utilizada pelas células da teca para sintetizar andrógenos (⁶⁰). StAR, CYP11a1 e CYP19a1 são as principais enzimas no processo de síntese hormonal (⁶¹) (Figura 3).

As células da granulosa expressam o receptor de estradiol, que contribui para o desenvolvimento folicular (⁶²). As atividades autócrinas e parácrinas do estradiol nas células da granulosa estimulam a atividade da enzima aromatase, aumentando a sensibilidade à gonadotrofina e a expressão do IGF-1 (⁵⁹). No ovário, o IGF-I estimula a esteroidogênese folicular e aumenta a produção de estradiol. A ausência de IGF-I resulta na interrupção do crescimento folicular na fase pré-antral/antral inicial, uma vez que estes folículos não respondem à gonadotrofina (⁶⁰,⁶¹). Nas células da granulosa, o efeito estimulador do FSH no CYP19 e na proteína quinase B (AKT) depende do IGF-I e da expressão e ativação do IGF-IR (61). Além disso, o FSH induz a produção de estradiol através da sinalização dependente de FSHR-cAMP para induzir a transcrição do gene CYP19A1 (⁷⁷). Após o recrutamento folicular, as gonadotrofinas reduzem gradativamente a proliferação das células da granulosa e induzem sua diferenciação para produzir estradiol (⁶⁸) (Figura 3).

5. Atresia folicular durante o desenvolvimento de folículos antrais iniciais

Ao nascer, os ovários contêm milhares de folículos, mas apenas uma pequena proporção se desenvolve até a ovulação, enquanto a grande maioria (~99,9) é perdida por atresia. A atresia folicular não ocorre igualmente durante o desenvolvimento folicular, diferindo entre folículos pré-antrais e folículos antrais (⁶⁸). Spanel-Borowski et al. (⁶⁹) relataram dois tipos de padrões atrésicos em folículos ovarianos, nomeadamente o tipo A, no qual o oócito degenera enquanto as células da granulosa permanecem intactas, e o tipo B, no qual as células da granulosa mostram sinais de degeneração extensa enquanto o oócito permanece inicialmente não afetado. O tipo A é a forma predominante de atresia nos folículos pré-antrais (⁷⁰), enquanto nos folículos antrais tardios apenas se observa o tipo B, sendoa apoptose das células da granulosa na presença a principal característica da atresia em folículos antrais grandes (⁶⁹). Nos folículos antrais iniciais, as primeiras alterações que indicam atresia ocorrem no oócito, como retração da cromatina nuclear e fragmentação do oócito, enquanto alterações nas células da granulosa nesses folículos são raramente encontradas (⁷⁰).

Quando o ambiente parácrino ou endócrino não é adequado para suportar o crescimento dos oócitos e/ou a proliferação e diferenciação de células foliculares, a atresia pode ocorrer através das vias de necrose, necroptose, autofagia e apoptose (⁷¹) (Figura 4). A via de necrose e necroptose apresentam características morfológicas semelhantes e são caracterizadas por aumento do volume celular, permeabilização e ruptura da membrana plasmática, que levam à morte celular (⁷¹). Geralmente, a necrose é iniciada por mecanismos não celulares, como isquemia, deficiência nos níveis de ATP e trauma, levando a danos celulares irreversíveis (⁷¹). A necroptose é iniciada pelo fator de necrose tumoral-α (TNFα) e operada através da proteína quinase-1 e 3, que interagem com seus receptores serina / treonina-proteína quinase 1 e quinase 3, respectivamente, bem como pelo domínio semelhante proteína de linhagem mista quinase (MLKL) (⁷¹). Zhou et al. (⁷²) mostraram que o processo de autofagia está envolvido com atresia em folículos secundários e antrais iniciais. A autofagia é uma forma evolutivamente conservada de processo intracelular que envolve proteínas e organelas danificadas para degradação e reciclagem (Figura 4).

Figura 4.
Mecanismos envolvidos na atresia em folículos antrais iniciais.

Acredita-se que a apoptose das células da granulosa nos folículos antrais tardios seja desencadeada por níveis insuficientes de FSH ou número reduzido de receptores de FSH (⁷³). A ausência de LH e o declínio do FSH circulante fazem com que os folículos subordinados diminuam o seu crescimento e, eventualmente, resulta em atresia (⁷⁴). O FSH protege as células da granulosa do dano oxidativo e resgata as células da granulosa da apoptose. Acredita-se que o FSH resgate as células da granulosa dos folículos antrais da apoptose por meio da ativação da via de transdução do sinal fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K)–AKT. A ativação da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K)/Akt através da ligação do FSH ao seu receptor leva à fosforilação da subfamília box O dos fatores de transcrição forkhead (FOXO), que influencia, entre outros processos, a sobrevivência das células da granulosa (⁷⁵).

6. Estratégias para o desenvolvimento in vitro de folículos antrais iniciais

Vários estudos investigaram a relação entre o tamanho folicular e oocitário com a aquisição de competência de desenvolvimento oocitária in vitro, e muitos estudos concentraram-se no desenvolvimento de protocolos de cultivo que podem apoiar o desenvolvimento de oócitos a partir de folículos antrais iniciais (Figura 5). Harada et al. (⁷⁶) demonstraram pela primeira vez que oócitos de 90,0 a 99,0 µm de folículos antrais iniciais (0,5 a 0,7 mm) de bovinos podem crescer e adquirir competência de desenvolvimento in vitro, na presença de hipoxantina e FSH. Da mesma forma, Yamamoto et al. (⁷⁷) demonstraram que, além de serem capazes de crescer e adquirir competência de desenvolvimento in vitro, oócitos (90,0 a 99,0µm) de pequenos folículos bovinos eram capazes de produzir descendentes após passarem por maturação, fertilização e posterior cultivo in vitro.

Figura 5.
Representação esquemática dos principais avanços no cultivo in vitro de folículos antrais precoces.

Ao cultivar folículos antrais isolados com diâmetro entre 0,2 e 0,5 mm, observou-se que, assim como os CCOs (0,4 e 0,7), os folículos também podem crescer durante o cultivo in vitro, e os oócitos atingem competência meiótica (⁷⁸). Na espécie caprina, além de obter melhora na maturação oocitária in vitro, foi relatada a produção de embriões a partir de oócitos provenientes de pequenos folículos antrais cultivados in vitro (⁷⁹). Cadenas et al. (⁸⁰) mostraram que folículos antrais iniciais de cabras cultivados em meio contendo insulina (10 ng/mL) associada ao hormônio do crescimento (50 ng/mL) são capazes de manter o crescimento e a maturação de oócitos in vitro em níveis semelhantes aos que cresceram in vivo. Da mesma forma, ao observar o efeito da estimulação do FSH humano recombinante (hrFSH) nos folículos antrais iniciais de cabra, o hrFSH melhorou o desenvolvimento do folículo antral de maneira dependente da concentração (⁸¹). Lopes e al. (⁸²) também demonstraram que folículos antrais inicias isolados de estroma ovariano caprino são capazes de crescer e sobreviver in vitro por um curto período de tempo, após passarem por um processo de vitrificação. Em bovinos, recentemente Cordeiro et al. (⁸³) relataram que a presença de N-acetilcisteína (NAC) no meio de cultivo de folículos antrais iniciais reduz os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e mantém a integridade dos oócitos durante o cultivo.

O cultivo in vitro de CCO e folículos isolados garante a comunicação bidirecional entre oócitos e células da granulosa através de projeções transzonais (TZPs), o que é crucial para a ocorrência de eventos moleculares necessários ao desenvolvimento folicular e oocitário até a ovulação. Tais eventos envolvem, além da separação cromossômica, a caracterização da maturação nuclear, envolvem também a distribuição de organelas citoplasmáticas, o estoque de RNAm, proteínas e outros fatores, que são cruciais para que o ovócito consiga retomar a meiose e apoiar a fertilização e o desenvolvimento embrionário (⁸⁴).

Alguns estudos já relataram o nascimento de bezerros vivos a partir de oócitos recuperados de folículos antrais iniciais, mas a viabilidade e a competência de desenvolvimento destes oócitos in vitro podem ser melhoradas (⁷⁷, ⁸⁵, ⁸⁶). Assim, nosso grupo de pesquisa tem se concentrado no desenvolvimento de protocolos de cultivo que favoreçam a aquisição de competência oocitária in vitro. Bezerra et al.(⁸⁷) demonstraram que hemissecções foliculares em associação com cilostamida apresentam efeito sinérgico na manutenção de oócitos na vesícula germinativa durante cultivo in vitro. Barrozo et al.(⁸⁸) mostraram que a presença desse NAC no meio de cultura aumenta a porcentagem de retomada meiótica e a distribuição de TZPs, bem como reduz os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROS), indicando que a inclusão de antioxidantes é importante para otimizar os sistemas de MIV. Este e outros autores (⁸⁹) sugeriram que o sistema de cultura bidimensional (2D) é mais adequado para culturas de oócitos de folículos antrais precoces com duração de até 4 dias, enquanto em períodos de cultura superiores a 4 dias, o sistema tridimensional (3D) é mais adequado.

A cultura de folículos antrais iniciais isolados também pode representar uma alternativa promissora para o fornecimento de oócitos competentes para utilização em protocolos de maturação in vitro (⁹⁰), uma vez que esta comunicação entre ovócitos e células da granulosa é mantida. Porém, a escolha do tamanho folicular é fundamental para a aquisição de competência no desenvolvimento oocitário. Já foi demonstrado que oócitos de folículos antrais inicias (1 e 2mm) apresentam competência significativamente reduzida em comparação com oócitos de folículos antrais maiores (>3mm) (³,⁴). Bezerra et al. (⁹⁰) demonstraram que os níveis de RNAm para transcritos envolvidos no processo de desenvolvimento do oócito, como histona com ligante específico do oócito (H1FOO), GDF-9 e ribonuclease poli (a) específica (PARN), aumentam em oócitos quando os folículos crescem de folículos antrais secundários para pequenos, médios e grandes.

7. Conclusões

O desenvolvimento de folículos antrais inicias até a dependência de gonadotrofinas envolve uma ampla gama de processos, que podem ser decisivos para o crescimento folicular, esteroidogênese e aquisição de competência oocitária. A interação mútua entre oócitos e células foliculares influencia diretamente o destino folicular e do oócito. Além disso, o cultivo in vitro de folículos antrais iniciais abre novas perspectivas para utilização de seus oócitos para fertilização in vitro e proporciona uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no controle de folículos antrais iniciais.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de estudo. J.R.V. Silva é pesquisador do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -CNPq (bolsa número 308737/2018-0).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Mar 2024
• Data do Fascículo
  2024

Histórico

• Recebido
  17 Abr 2023
• Aceito
  05 Set 2023
• Publicado
  08 Jan 2024