Avaliação bioquímica dos efeitos do pré-condicionamento isquêmico após isquemia e reperfusão hepática em ratos

Biochemical assessment of ischemic preconditioning after hepatic ischemia and reperfusion in rats

Resumos

OBJETIVO: Comparar a lesão hepatocelular ocasionada pelo emprego do pré-condicionamento isquêmico e de duas outras modalidades de clampeamento tríade portal: clampeamento contínuo e intermitente. MÉTODO: Quarenta ratos Wistar foram divididos em quatro grupos de 10 animais cada. No Grupo Sham nenhuma espécie de clampeamento foi adotada. Nos outros três, provocamos isquemia de quarenta minutos por meio do clampeamento do pedículo hepático. No Grupo I esta isquemia foi contínua. No Grupo II, também contínua, mas precedida de cinco minutos de isquemia e 10 minutos de reperfusão (précondicionamento isquêmico). No Grupo III foi realizada isquemia intermitente em ciclos de 10 min de isquemia e cinco minutos de reperfusão. Para avaliar a lesão hepatocelular foi adotada a dosagem de transaminase glutâmico oxalacética (TGO), glutâmico pirúvica (TGP) e lactato desidrogenase (LDH), aferidas no início e no final dos procedimentos. RESULTADOS: Não houve diferença estatística nos valores basais das enzimas estudadas, demonstrando uniformidade nos grupos. Os quatro grupos apresentaram variação significativa de todas as enzimas entre os dois momentos de coleta, porém de forma diferenciada. A variação no Grupo Sham foi menor que a do grupo II. Este foi semelhante ao grupo III e em todos a elevação foi significativamente menor que no grupo I (D do Sham CONCLUSÕES: Em ratos Wistar o clampeamento contínuo do pedículo hepático, precedido de um ciclo de cinco minutos de isquemia e 10 minutos de reperfusão (pré-condicionamento isquêmico) provoca menor lesão hepática do que o clampeamento contínuo e apresenta resultados comparáveis aos obtidos através da utilização do clampeamento intermitente, em fígados normais submetidos a um período de isquemia hepática de 40 minutos e um tempo total de cirurgia de 60 minutos.

Fígado; Isquemia; Reperfusão; Ratos Wistar

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação bioquímica dos efeitos do pré-condicionamento isquêmico após isquemia e reperfusão hepática em ratos

Biochemical assessment of ischemic preconditioning after hepatic ischemia and reperfusion in rats

Fábio Neves da Silva, TCBC-RJ^I; Ricardo Antonio Refinetti, TCBC-RJ^II; José Marcus Raso Eulálio, TCBC-RJ^III

^IMestre e Doutor em Cirurgia pela Faculdade de Medicina da UFRJ

^IIProfessor Titular do Departamento de Cirurgia Faculdade de Medicina da UFRJ

^IIIProfessor Adjunto do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da UFRJ

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Comparar a lesão hepatocelular ocasionada pelo emprego do pré-condicionamento isquêmico e de duas outras modalidades de clampeamento tríade portal: clampeamento contínuo e intermitente.

MÉTODO: Quarenta ratos Wistar foram divididos em quatro grupos de 10 animais cada. No Grupo Sham nenhuma espécie de clampeamento foi adotada. Nos outros três, provocamos isquemia de quarenta minutos por meio do clampeamento do pedículo hepático. No Grupo I esta isquemia foi contínua. No Grupo II, também contínua, mas precedida de cinco minutos de isquemia e 10 minutos de reperfusão (précondicionamento isquêmico). No Grupo III foi realizada isquemia intermitente em ciclos de 10 min de isquemia e cinco minutos de reperfusão. Para avaliar a lesão hepatocelular foi adotada a dosagem de transaminase glutâmico oxalacética (TGO), glutâmico pirúvica (TGP) e lactato desidrogenase (LDH), aferidas no início e no final dos procedimentos.

RESULTADOS: Não houve diferença estatística nos valores basais das enzimas estudadas, demonstrando uniformidade nos grupos. Os quatro grupos apresentaram variação significativa de todas as enzimas entre os dois momentos de coleta, porém de forma diferenciada. A variação no Grupo Sham foi menor que a do grupo II. Este foi semelhante ao grupo III e em todos a elevação foi significativamente menor que no grupo I (D do Sham < D do Grupo II = D Grupo III < D Grupo I).

CONCLUSÕES: Em ratos Wistar o clampeamento contínuo do pedículo hepático, precedido de um ciclo de cinco minutos de isquemia e 10 minutos de reperfusão (pré-condicionamento isquêmico) provoca menor lesão hepática do que o clampeamento contínuo e apresenta resultados comparáveis aos obtidos através da utilização do clampeamento intermitente, em fígados normais submetidos a um período de isquemia hepática de 40 minutos e um tempo total de cirurgia de 60 minutos.

Descritores: Fígado; Isquemia; Reperfusão; Ratos Wistar.

ABSTRACT

BACKGROUND: To compare the hepatocyte injury due to the employment of previous ischemic conditioning and two other commonly used maneuvers for clamping the portal triad : continuous clamping and intermittent clamping.

METHODS: 40 Wistar rats were divided in 4 groups .On the SHAM group, no clamping was performed. On the other 3 groups , a 40 minutes ischemia was induced by clamping the portal triad. On the Group I we performed a continuous ischemia . On the Group II , before the continuous clamping , a 5 minutes ischemia and a 10 minutes reperfusion was performed (i.e. previous ischemic conditioning).On Group III an intermittent clamping was performed in a 10 minutes ischemia and 5 minutes reperfusion cycle. In order to assess the hepatocyte injury, the Oxalacetic transaminase (SGOT), the pyruvic transaminase (SGPT) , as well the lactic desidrogenase (LDH) were titled before and after the procedures.

RESULTS: There was no difference between the values of the starting samples on all the groups , revealing the uniformity of them. The four groups presented significant differences in the starting and ending samples. The odds of SHAM group were lesser significant then in the Group II , that was similar to the group III and in all the groups the rising was significant lower then the Group I (Δ SHAM < Δ Group II = Δ Group III < Δ Group I).

CONCLUSION: On Wistar rats , the continuous clamping after the previous ischemic conditioning , induced a minor hepatocyte injury in comparison to the continuous clamping alone and is similar to the intermittent clamping in normal livers, submitted to 40 minutes of hepatic clamping in a whole 60 minutes procedure.

Key words: Liver; Ischemia; Reperfusion; Rats, Wistar.

INTRODUÇÃO

Quando o fluxo sanguíneo aferente ao fígado é interrompido, objetivando menor perda sanguínea durante a secção do parênquima hepático, devemos lembrar que o tecido remanescente está sendo privado do aporte de oxigênio o que acarretará graus variáveis de lesão celular. Tanto o sangramento excessivo quanto a isquemia celular interferem diretamente na morbidade e mortalidade operatórias.

Diversas substâncias liberadas durante o processo de isquemia/reperfusão têm sido identificadas e seu papel no dano celular, estudados^1-6. Frente a este fato, seguiram-se os trabalhos com a intenção de avaliar a interferência na liberação destas substâncias no tecido hepático ^4,7-11.

Este experimento reproduz situações de isquemia hepática com o objetivo de avaliar e comparar o dano celular hepático, por meio da dosagem enzimática, com a utilização do pré-condicionamento isquêmico com outras duas modalidades de clampeamento da tríade portal: clampeamento contínuo e intermitente.

MÉTODO

Foram utilizados 40 ratos Wistar, pesando entre 280 e 370 gramas provenientes do Centro de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da U.F.R.J. O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa em Animais de Laboratório - CEPAL-UFRJ. Todos os animais foram mantidos em condições idênticas de alimentação e água, oferecidos, sem restrição, no período préoperatório. Foram submetidos ao jejum de 12 horas , sendo aleatória a escolha do animal na composição dos grupos. A indução da anestesia foi obtida com éter em campânula fechada onde o animal era alocado. Após a perda da consciência era transferido para a mesa cirúrgica e fixado. Realizava-se tricotomia abdominal ampla e anti-sepsia com polivinilpirrolidona iodo. Era administrado, a seguir, por via intraperitoneal 10 mg/kg de cetamina e 60 mg/kg de xilazina. Aguardava-se aproximadamente 5 minutos para a ação das drogas para então iniciar a operação. O acesso à cavidade abdominal foi obtido por meio de incisão mediana, partindo do apêndice xifóide e estendendo-se 5 cm no sentido caudal.

As amostras de sangue foram colhidas, por cateterismo da veia cava inferior infra-hepática com extracath número 22, no início e ao final de 60 minutos de procedimento operatório. Estas amostras eram acondicionadas, centrifugadas e analisadas no mesmo dia para dosagem de transaminase glutâmico oxalacética (TGO), transaminase glutâmico pirúvica (TGP) e lactato desidrogenase (LDH).

Os quarenta animais foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada de acordo com o procedimento utilizado (Figura 1). No Grupo Sham nenhuma espécie de clampeamento foi adotada. Nos outros três, provocamos isquemia de quarenta minutos por meio do clampeamento do pedículo hepático. No Grupo I esta isquemia foi contínua. No Grupo II, também contínua, mas precedida de 5 minutos de isquemia e 10 minutos de reperfusão (pré-condicionamento isquêmico). No Grupo III foi realizada isquemia intermitente em ciclos de 10 min de isquemia e 5 min de reperfusão.

Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística pelas técnicas de análise variância one way (TGO, TGP), ANOVA de Kuskal-Wallis (LDH), teste t de Student emparelhado, teste de postos sinalizados de Wilcoxon e teste de variações múltiplas, dependendo do objetivo ou enzima a ser avaliado (a). Foi definido como significativo um p valor < 0,05.

RESULTADOS

Os valores obtidos pela dosagem das três enzimas estudadas em cada animal, isoladamente, estão listados na Tabela 1. Os quatro grupos foram considerados comparáveis por apresentar o mesmo sexo, peso semelhante, por terem sido submetidos às mesmas condições pré-operatórias e anestésicas e por terem sido submetidos ao mesmo tempo operatório.

Análise Estatística

Houve diferença significativa nas variações absolutas de TGO (p=0,0001), TGP (p=0,0001) e LDH (p=0,0001) entre os grupos, mas de forma diferenciada (Figuras 2,3,4). A variação média da TGO do grupo Sham foi significativamente menor que dos grupos GI, GII e GIII; e no grupo GI foi significativamente maior que nos grupos GII e GIII, ao nível de 5%. Não houve diferença significativa entre os grupos GII e GIII.

Os grupos apresentaram, portanto, um aumento enzimático estatisticamente significativo do início para o final da cirurgia, porém de forma diferenciada, ou seja:

D do Sham < D do Grupo II = D Grupo III < D Grupo I

DISCUSSÃO

A interrupção, por um curto período, do fluxo sanguíneo aferente ao fígado, seguido de reperfusão por um tempo variável, protege o órgão de um segundo, e mais prolongado, clampeamento. Tentou-se neste trabalho, então, reproduzir os mesmos bons resultados do PI em fígados de ratos normais submetidos a um período prolongado de isquemia.

Além das enzimas estudadas, outras substâncias, bem como as alterações histológicas e celulares têm sido utilizadas para quantificar o grau de lesão hepática, como a atividade inflamatória, índice de apoptose, ativação de células de Kupffer, interação leucócito-endotelial e o estado redox mitocondrial ^12-14. Também destacam-se estudos com os níveis de xantina e o grau de conversão de xantina-desidrogenase em xantina-oxidase^4,15, produção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), a expressão de RNAm^5,16,17 ou a geração de radicais livres¹⁰. Enfim, uma série de substâncias, sejam elas intracelulares, mediadores inflamatórios, assim como alterações microcirculatórias, histológicas ou celulares podem ser empregadas com segurança neste tipo de avaliação¹⁸.

Foi selecionada neste estudo a concentração sérica das transaminases glutâmico oxalacética (TGO) e glutâmicopirúvica (TGP), assim como da lactato desidrogenase (LDH) como parâmetro de lesão celular. Apesar de existirem muitas opções entre as substâncias utilizadas para qualificar e quantificar a lesão isquêmica do hepatócito, optou-se pela dosagem de TGO, TGP e LDH pela facilidade de execução e pela grande freqüência com que são utilizadas sejam isoladamente ou acompanhadas de outros métodos de avaliação ^{2,5- 7,11,14,16,17,19-23}. Além disso, são efetivamente as mais utilizadas na prática clínica para o acompanhamento dos pacientes.

Para que não houvesse interferência do tempo operatório e anestésico nos resultados, manteve-se nos quatro grupos o mesmo tempo operatório (60 minutos) e nos três submetidos a clampeamentos, o mesmo tempo de isquemia (40 minutos).

Como resultado deste experimento, obteve-se elevação média das três enzimas estudadas em todos os quatro grupos entre o início e o final da operação. As variações da TGO no grupo Sham não foram significativas (p=0,057). No entanto, o mesmo não aconteceu com as alterações da TGP e LDH neste grupo que apresentaram um p valor de 0,046 e 0,002 respectivamente. Acreditamos que estas alterações significativas possam decorrer da resposta ao trauma cirúrgico/ anestésico, combinado à diminuição da volemia pela coleta de sangue, mas não houve estudo específico a este respeito. Nos demais grupos houve alteração bastante significativa (p=0,0001) nos níveis de TGO e TGP. As variações da LDH, apesar de estatisticamente significativas não foram tão intensas quanto das outras duas enzimas.

Quando comparados os quatro grupos entre si, observou- se diferença significativa nas variações absolutas das três enzimas entre eles (p=0,0001). Desta forma, pode-se notar que todos os grupos apresentaram elevação significativa nos níveis séricos das enzimas estudadas do início para o final da cirurgia, porém de forma diferenciada. A variação no grupo Sham foi menor que a do grupo II, que foi semelhante ao do grupo III que foi menor do que a do grupo I (D do Sham < D do Grupo II = D Grupo III < D Grupo I). A análise destes dados nos permitiu verificar que tanto o clampeamento intermitente quanto o précondicionamento isquêmico provocam mais lesão hepática que o grupo Sham, porém em menor intensidade que no grupo de isquemia contínua. Não houve vantagem estatística na utilização de um ou outro método de proteção tecidual hepática. Parece- nos, entretanto, que o emprego do PI traria vantagens à adoção do CI por evitar as freqüentes interrupções no procedimento cirúrgico, necessárias neste último.

A função citoprotetora do pré-condicionamento isquêmico (PI) verificada no estudo vem ao encontro de resultados semelhantes encontrados nas recentes publicações científicas. Vale destacar os benefícios de uma isquemia de 5 minutos precedendo outros 30 minutos sem perfusão hepática, quando comparados a um grupo isquêmico para controle¹². Trabalhos recentes demonstraram vantagens do PI em fígados transplantados^3,17, confirmando o experimento de Fernandez, em Barcelona¹⁵. Assim como no nosso estudo, Rudiger¹⁴ comparou os resultados do PI com os obtidos pelo CI. Apresentou uma conclusão interessante. Tanto o pré-condicionamento isquêmico quanto o clampeamento intermitente são efetivos na proteção hepatocelular em períodos de isquemia prolongada. O PI foi superior ao CI em períodos de até 75 minutos por não estar associado à perda sanguínea durante a transecção hepática. Entretanto, para períodos mais prolongados (acima de 75 minutos) o CI mostrou-se superior. Iwasaki ², em trabalho experimental, mostrou a somatória dos benefícios do pré-condicionamento isquêmico em relação ao clampeamento intermitente. Dividiu seus animais em 5 grupos: grupo sham, isquemia contínua com ou sem PI e isquemia contínua com ou sem PI. Concluiu que o PI exerce um maior efeito protetor quando a isquemia hepática é intermitente. Glanemann¹³, também comprova o benefício citoprotetor do PI e sugere que um dos possíveis mecanismos envolvidos, os quais ainda não estão completamente compreendidos, seja a preservação do estado redox das mitocôndrias, garantido pela prevenção da ativação das células de Kupffer e da falência de perfusão sinusoidal. Outro possível mecanismo envolvido foi descrito por Teoh⁶ em 2002. Trata-se da ativação de substâncias associadas à entrada dos hepatócitos no ciclo celular, um efeito biológico crítico que favorece a sobrevida do fígado contra a injúria de isquemia/reperfusão. O metabolismo das xantinas, o fator de necrose tumoral alfa, a regulação microcirculatória entre outros também têm sido envolvidos nos bons resultados do PI ^{3, 5, 15, 17}.

Vários trabalhos, no entanto, que compararam diversas modalidades de clampeamento, mesmo que com a utilização de intervalos de isquemia e reperfusão diferentes ou de animais doentes ou sadios, chegaram às mesmas conclusões: há benefício da utilização do clampeamento intermitente e do pré-condicionamento isquêmico, especialmente em situações de necessidade de isquemia prolongada. A opção entre os métodos dependerá da resposta hemodinâmica do paciente a um período maior de isquemia hepática contínua comparada ao maior tempo operatório proporcionado pela isquemia intermitente.

Os dados encontrados em nossa experimentação nos permitiram concluir que em ratos de Wistar o clampeamento contínuo do pedículo hepático, precedido de um ciclo de 5 minutos de isquemia e 10 minutos de reperfusão (pré-condicionamento isquêmico) provoca menor lesão hepática do que o clampeamento contínuo e apresenta resultados comparáveis aos obtidos através da utilização do clampeamento intermitente, em fígados normais submetidos a um período de isquemia hepática de 40 minutos e um tempo total de cirurgia de 60 minutos.

Fábio Neves da Silva

Av. Ataulfo de Paiva, 1460/801

Leblon

22240-031- Rio de janeiro – RJ

E-mail: [e-mail]

Parte da Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da Faculdade de Medicina da UFRJ. como parte dos requisitos para conclusão do Curso de Doutorado.

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Endereço para correspondência

Recebido em 20/06/06

Aceito para publicação em 25/07/06

Conflito de interesses: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Mar 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Recebido
  20 Jun 2006
• Aceito
  25 Jul 2006